田玉橋，尹火青，陳三春，尹慶鐵，岳文閣，曾申磊，邱小燕，2，*

（1.湖南省博世康中醫(yī)藥有限公司，湖南懷化418008；2.懷化學院生物與食品工程學院民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南懷化418008）

茯苓，為多孔菌科真菌茯苓（Poria cocos（Schw.）Wolf）的干燥菌核，是我國傳統(tǒng)名貴、藥食兩用中藥材，具有利水滲濕、健脾安神等功效，主要用于水腫尿少、痰飲眩暈、脾虛食少、便溏泄瀉、心神不安、驚悸失眠等癥[1]。茯苓的有效成分主要是茯苓多糖，現(xiàn)代藥理學試驗研究表明，茯苓多糖具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、提高免疫力等作用，對人體具有較高的保健功能和藥用價值，在許多藥品配方中都見其身影，中醫(yī)臨床配伍率達70%以上[2]。

目前對茯苓品質(zhì)的研究主要集中在不同加工方式對其有效成分的影響，田玉橋等[3]在對不同天氣和季節(jié)采收的茯苓加工工藝和品質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，秋季晴天采收的茯苓比春季雨天采收的浸出物含量高出16.74%；徐雷等[4]在不同初加工方法對茯苓多糖和三萜類成分的影響研究中發(fā)現(xiàn)趁鮮切制與發(fā)汗切制的茯苓飲片多糖平均含量分別為87.77%和91.44%，茯苓飲片三萜類成分平均含量分別為2.318‰和2.334‰。不同采收期對茯苓品質(zhì)的影響研究鮮見相關報道。

在湘黔鄂及四川、安徽等茯苓傳統(tǒng)栽種地區(qū)，一般每年的4月～7月下料接種；云南地區(qū)由于一年中氣溫變化不大，四季均可栽種。茯苓的采收期主要根據(jù)藥農(nóng)的經(jīng)驗判斷，并無明確的最適采收期，且有部分藥農(nóng)為了讓藥材提前上市，取得更大的經(jīng)濟效益而提前采挖，成為茯苓藥材質(zhì)量不穩(wěn)定的重要原因之一。本試驗研究不同采收期對茯苓品質(zhì)的影響，確定適宜采收期，為制訂茯苓產(chǎn)地初加工工藝標準和規(guī)范提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

UV-1800型紫外-可見分光光度計：島津儀器（蘇州）有限公司；AL204型電子天平（萬分之一）、MS105型電子天平（十萬分之一）：梅特勒-托利多（成都）有限公司；TDL-60B型離心機：上海安亭儀器設備有限公司；Milli-QAdvantageA10型一體式超純水機：美國Milipore公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市晶玻實驗儀器廠；HL-200A型高速多功能粉碎機：上海耐塞機械有限公司。

葡萄糖對照品：中檢院，批號：110833-201605；茯苓酸：上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號：201703P0734；5%苯酚（稱取苯酚5 g于100 mL棕色容量瓶中，加水溶解至刻度）：南京化學試劑股份有限公司；濃硫酸：優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司；95%乙醇：分析純，天津市富宇精細化工有限公司。

茯苓樣品：茯苓樣品全部采集于湖南省博世康中醫(yī)藥有限公司在云南省硯山縣六召鄉(xiāng)建設的茯苓規(guī)范化藥源生產(chǎn)基地，該茯苓基地在2017年3月下旬已全部接種完成，經(jīng)過規(guī)范化的栽培管理，選取光照、土壤、坡度、海拔、植被環(huán)境等因素一致的栽種試驗地，于2017年9月和12月及2018年6月下旬分別取樣，每批采集試驗樣品3個重復，每批200 kg左右，隨機挑選外表無機械損傷、無腐爛的新鮮茯苓，具體采集信息見表1。將采集的茯苓樣品經(jīng)過凈制、蒸制、切制、干燥、篩選等工序加工成0.8 cm×0.8 cm×0.8 cm的中丁，從每批次加工好的成品（茯苓丁和茯苓皮）隨機取500 g樣品，備用。

表1 不同生長期茯苓樣品采集信息表Table 1 Information of Poria cocos samples with different growth periods

1.2 方法

1.2.1 處理

本試驗設第一生長期（6個月）、第二生長期（9個月）、第三生長期（12個月）、第四生長期（15個月）4個處理。

1.2.2 水分測定

稱取茯苓藥材粉末（過三號篩）各3 g左右，按《中國藥典》2015年版四部0832水分測定法第二法（烘干法），分別測定24批茯苓樣品的含水量。

1.2.3 浸出物的測定

稱取茯苓飲片粉末（過四號篩）各4 g左右，用稀乙醇（95%的乙醇加水稀釋至1 000 mL）做溶劑，按《中國藥典》2015年版四部浸出物測定法測定，醇溶性浸出物測定法（熱浸法），依法測定，分別測定24批茯苓樣品的浸出物含量。

1.2.4 茯苓多糖測定

1.2.4.1 制備對照品溶液

精密稱取減壓干燥至恒重的葡萄糖對照品25.02mg至25 mL棕色容量瓶中，加水制成濃度為1 mg/mL的儲備液。精密吸取對照品儲備液0.4 mL置10 mL棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，備用。

1.2.4.2 制備供試品溶液

取茯苓藥材粉末（過四號篩）約5 g，置燒瓶中，精密加入水100 mL，稱定重量，水浴回流2 h，補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液50 mL，濃縮至5 mL。加入95%乙醇25 mL，醇沉濃度為80%。放置過夜，離心（3 500 r/min，15 min）。棄去上清液，沉淀用蒸餾水溶解并定容至100 mL，備用，測定水溶性茯苓多糖。取茯苓飲片粉末（過四號篩）約1 g，置燒瓶中，加石油醚50 mL于水浴回流2 h，冷卻，過濾，濾渣干燥后加1 mol/L NaOH 100 mL，超聲處理 1 h（360 W，50 kHz），離心（3 500 r/min，15 min），取上清液。上清液加 25%冰醋酸溶液調(diào)pH5～6，使其成糊狀。置冰箱中冷藏過夜，將糊狀物離心（3 500 r/min，10 min），棄去上清液，沉淀加水溶解，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取2 mL置50 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，備用，測定堿溶性茯苓多糖。

1.2.4.3 茯苓多糖的測定

采用苯酚－硫酸法在490 nm處測定對照品和供試品溶液的吸光度[5]。

1.2.5 茯苓總?cè)茰y定

1.2.5.1 制備對照品溶液

精密稱定105℃下干燥至恒重的茯苓酸對照品15 mg左右。置于25 mL容量瓶中，用色譜甲醇溶解并定容至刻度，即得濃度為0.603 mg/mL茯苓酸對照品溶液。

1.2.5.2 制備供試品溶液

精密稱定茯苓粉末（過四號篩）2.0 g左右，置于具塞錐形瓶中，加入乙酸乙酯60 mL，稱定重量，超聲（功率300 W，頻率50 MHz）60 min，放冷后，用乙酸乙酯補足減失的重量，過濾，即得。

1.2.5.3 茯苓總?cè)茰y定

精密移取0.2 mL茯苓酸對照品溶液，0.10 mL供試品溶液分別置于10 mL試管中，水浴揮干溶劑，再加入0.4 mL5%的香草醛冰醋酸溶液和1.8 mL高氯酸，密塞，70℃水浴20 min，放冷后加入5 mL冰醋酸，搖勻。采用紫外可見分光光度法[6]，在535 nm處測定對照品和供試品溶液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每一批茯苓樣品的水分、浸出物、茯苓多糖重復3次測定，取其平均值，并采用SPSS 22對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯苓成品水分及浸出物含量

藥材在貯藏過程中，水分含量是影響藥材質(zhì)量的關鍵因素，因為水分含量是藥材質(zhì)量變化的介質(zhì)，藥材水分過量，極易霉爛變質(zhì)，使得有效成分被分解，造成藥材質(zhì)量下降[7]。本試驗所采集的樣品干燥加工均采用無硫低溫烘干技術，工藝成熟，產(chǎn)品均一穩(wěn)定。不同生長期的茯苓丁水分及浸出物含量測定結(jié)果如表2所示，不同生長期的茯苓皮水分及浸出物含量測定結(jié)果如表3所示，4個不同生長期的茯苓丁及茯苓皮含水量均無顯著性差異（P＞0.05），且符合2015版藥典對茯苓丁和茯苓皮水分含量不得過18.0%和15.0%的最低限度要求，水分在儲藏運輸較合理的水平區(qū)間內(nèi)。

表2 不同生長期茯苓丁水分及浸出物含量Table 2 Contents of water and extract of Poria cocos in different growth periods

表3 不同生長期茯苓皮水分及浸出物含量Table 3 Contents of water and extract of Poria cocos skin in different growth periods

茯苓質(zhì)量標準收藏于《中國藥典》，浸出物測定是茯苓質(zhì)量控制的重要指標[8]。茯苓必須經(jīng)過干燥后方可入藥，且浸出物質(zhì)量分數(shù)不得少于2.5%。本試驗第三生長期的茯苓丁浸出物含量最高（4.97%），顯著（P＜0.05）高于第一、第二和第四生長期，第一生長期的茯苓丁浸出物含量最低（2.24%），且低于藥典標準。第三生長期的茯苓皮浸出物含量最高（10.28%），顯著（P＜0.05）高于第二和第一生長期，第一生長期的茯苓皮浸出物含量最低（5.87%），且低于藥典標準。第四生長期的茯苓丁和茯苓皮浸出物含量相對于第三生長期均有所下降，分別為10.86%和7.68%。

2.2 茯苓多糖含量

茯苓多糖是茯苓最有效的成分之一，具有免疫機能、防治腫瘤、抗炎等生物學活性[9]，該糖具有增強巨噬細胞和T淋巴細胞的細胞毒作用，還能增強細胞的免疫反應并激活機體對腫瘤的免疫監(jiān)視系統(tǒng)[10]。豐朝霞等[11]研究表明茯苓多糖大多分布于中藥材茯苓的細胞壁組織中，主要分為水溶性多糖和堿溶性多糖。張曉娟等[12]研究表明茯苓中堿溶性多糖占85%左右，堿溶性多糖能夠轉(zhuǎn)化為具有較高活性的羧甲基茯苓多糖。袁娟娟等[13]在研究茯苓中茯苓多糖含量與產(chǎn)地關系的對比探討時，發(fā)現(xiàn)中藥材道地產(chǎn)區(qū)種植的茯苓如云南，茯苓多糖含量高達88.2%，藥材品質(zhì)最好。本試驗中茯苓丁的多糖含量測定結(jié)果見表4，第三生長期的茯苓丁水溶性多糖含量最高（0.39%），顯著（P＜0.05）高于第一、二及第四生長期，第一生長期茯苓丁的水溶性多糖含量最低（0.17%）。第三生長期茯苓丁的堿溶性多糖含量高（86.68%），顯著（P＜0.05）高于第一、二及第四生長期，第一生長期茯苓丁的堿溶性多糖含量最低（67.34%）。茯苓皮的多糖含量測定結(jié)果見表5，第三生長期茯苓皮的水溶性多糖含量最高（0.26%），顯著（P＜0.05）高于第一、二及第四生長期，第一生長期茯苓皮的水溶性多糖含量最低（0.10%）。第三生長期茯苓皮的堿溶性多糖含量高（73.50%），顯著（P＜0.05）高于第一、二生長期，第一生長期茯苓皮的堿溶性多糖含量最低（53.70%）。第四生長期茯苓丁和茯苓皮的多糖含量相對于第三生長期均有所下降。結(jié)果表明第三生長期采收的茯苓丁及茯苓皮堿溶性多糖含量最高，質(zhì)量最好。

表4 不同生長期茯苓丁的茯苓多糖含量Table 4 Contents of Poria cocos polysaccharides in different growth stages

表5 不同生長期茯苓皮的茯苓多糖含量Table 5 Contents of Poria cocos skin polysaccharides in different growth stages

2.3 茯苓總?cè)坪?/h3>

中外學者對茯苓的化學成分及生物活性研究發(fā)現(xiàn)，其所含的大量三萜類物質(zhì)具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、拮抗醛固酮[14]、誘導分化白血病細胞系HL-60等藥理活性[15]，建立茯苓三萜類的分析測定體系對于茯苓藥材內(nèi)在質(zhì)量的控制具有重要意義。沈思等[16]采集了湖北羅田的茯苓皮用香草醛-冰乙酸-高氯酸顯色法進行測定，茯苓皮中的三萜百分含量為1.58%。易中宏等[17]用分光光度法測定茯苓中總?cè)祁惓煞值暮浚Y(jié)果表明，不同產(chǎn)地茯苓藥材中總?cè)坪康拇蟾欧秶鸀?.492%～1.02%之間。本試驗中茯苓丁和茯苓皮的總?cè)坪拷Y(jié)果見表6。

表6 不同生長期茯苓丁和茯苓皮的總?cè)坪縏able 6 Contents of total triterpenoid in different growth stages of poria cocos and poria cocos skin

第三生長期茯苓丁的總?cè)坪孔罡撸?.74%），顯著（P＜0.05）高于第一、二和第四生長期。第三生長期茯苓皮的總?cè)坪扛撸?.06%），顯著（P＜0.05）高于第一、二和第四生長期，第一生長期茯苓皮的總?cè)坪孔畹停?.47%）。前三個生長期茯苓丁和茯苓皮的總?cè)坪烤胁煌潭鹊脑黾?，但第四生長期相對第三生長期顯著（P＜0.05）下降。

中藥材有效成分的累積除了受遺傳基因的調(diào)控和生長環(huán)境的影響外，還與采收時間、加工、干燥方法、貯藏和炮制密切相關，其中采收期時間是一個十分重要的環(huán)節(jié)[18]。藥材的采收時間直接影響藥材的品質(zhì)、產(chǎn)量及收獲效率，適期采收對藥材的品質(zhì)、產(chǎn)量和收獲效率都有良好作用。現(xiàn)代研究表明，由于每種中藥材自身屬性、生長環(huán)境等因素的差異性采收期也有很大的不同。甘肅岷縣等地的當歸最佳采收期為每年的秋末冬初[19]；開花型灰山銀花的適宜采收期為大白期，花蕾型山銀花的適宜采收期為青白期[20]。本試驗結(jié)果表明，第一生長期的茯苓丁和茯苓皮的平均浸出物含量均未達到2015版《中國藥典》最低限度標準；第二和第三生長期的茯苓丁和茯苓皮的平均浸出物含量均達到了國家藥典標準，但第三生長期的茯苓丁和茯苓皮平均浸出物含量更高，分別超出國家藥典標準91.6%和71.33%。第二生長期和第三生長期的采收的樣品相對于第一生長期采收的樣品多糖和總?cè)坪烤写蠓鹊脑黾?。但是第四生長期相對于第三生長期采收的樣品在浸出物和多糖及總?cè)坪可暇兴陆怠?/p>

3 結(jié)論

在前3個生長期，隨著茯苓生長時間的增加，其浸出物、水溶性茯苓多糖、堿溶性多糖及總?cè)坪烤粩嘣黾樱谌L期的茯苓丁和茯苓皮浸出物含量最高，分別為4.97%和 10.28%，均顯著（P＜0.05）高于第一和第二生長期。第三生長期茯苓的水溶性、堿溶性多糖及總?cè)坪孔罡?，顯著（P＜0.05）高于第一、二生長期；但生長期達到12個月之后，茯苓的有效成分有所下降。為了保證生產(chǎn)加工后的茯苓藥材和飲片質(zhì)量達標，建議茯苓的生長期在9～12個月時進行采收加工。