廖雪華，甘育鴻，梅思，符偉玉，吳科鋒，4，*，李文德

（1.廣東醫(yī)科大學(xué)廣東天然藥物研究與開發(fā)實驗室，廣東湛江524023；2.梅州市人民醫(yī)院，廣東梅州514000；3.廣東醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所，廣東湛江524023；4.廣東醫(yī)科大學(xué)南海海洋醫(yī)藥研究院，廣東湛江524023；5.廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣東廣州510000）

黑色素瘤又稱惡性黑色素瘤，是由分布于神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞所形成的痣或色素斑惡化而成，其惡性程度高，具有高度侵襲性，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，是目前為止導(dǎo)致死亡人數(shù)最多的皮膚腫瘤[1-2]。黑色素瘤主要發(fā)生在皮膚，但也可發(fā)生于眼睛、腸道及體內(nèi)含有黑色素細(xì)胞的任何部分[3-4]。早期黑色素瘤可以通過手術(shù)切除達(dá)到有效治療，但中晚期惡性黑色素瘤對常規(guī)的放療、化療不敏感，缺乏有效的治療手段[5-6]，且常規(guī)的化療藥物存在不良反應(yīng)大，患者依從性差等特點[7]。因此，從天然的中藥材中尋找有效的抗黑色素瘤藥物成為研究的熱點。

黃皮果為蕓香科植物黃皮 [Clausena lansium（Lour.）Skeels]的成熟果實，是藥食同源的民間藥材，其肉、皮和核皆可入藥[8]。黃皮果核具有行氣止痛、健胃消腫等多方面的生物活性，常用于治療胃痛、疝痛、痛經(jīng)和風(fēng)濕骨痛[9]。大量文獻(xiàn)報道，黃皮果揮發(fā)油主要成分為萜類、醇類、酯類、酮類及醛類，進(jìn)一步的研究也指出，該揮發(fā)油具有殺蟲、抑菌、抗氧化等作用[10-11]。前期研究發(fā)現(xiàn)黃皮果核揮發(fā)油主要成分為烯醇類，占揮發(fā)油成分的56.74%以上，并可改善因紫外線引起的皮膚老化損傷[12]，而對于其抗腫瘤活性及其他生物活性的研究鮮見報道。因此希望進(jìn)一步探究該揮發(fā)油抗黑色素瘤細(xì)胞增殖作用的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞：中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 試劑與儀器

黃皮果核揮發(fā)油（essential oil of kernel，EOK）：廣東醫(yī)科大學(xué)天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室保存[12]；磷脂酰絲氨酸蛋白抗體/碘化丙啶（Annexin V-FITC/propidiun iodide，Annexin V-FITC/PI） 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒：北京莊盟國際生物基因科技有限公司；0.25%胰酶溶液（1x）：吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；超敏ECL（electro-chemi-luminescence）化學(xué)發(fā)光試劑盒（BeyoECL Plus）、羅丹明 123（rhodamine 123，Rh 123）、放射免疫沉淀（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清、高糖培養(yǎng)基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、磷酸鹽緩沖液（phosphote buffered soline，PBS）：美國 Gibco公司；青霉素-鏈霉素雙抗溶液：廣州威佳科技有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]：Sigma 公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美國 SANTA CRUZ公司；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 凝膠快速配置試劑盒：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；預(yù)染蛋白標(biāo)記：美國 Thermo公司；β-肌動蛋白（β-actin）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、P65、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase 3等一抗：美國SAB公司；一抗稀釋液、二抗稀釋液：Biosharp公司；0.22 μm聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）：美國 Millipore公司。

IX73型倒置熒光顯微鏡：Olympus公司；通用水套CO2培養(yǎng)箱：美國Thermo公司；SW-CJ-1D單人單面垂直凈化工作臺：江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司；HR/T16MM微量高速冷凍離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；SHA-B數(shù)顯恒溫水浴震蕩器：天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠；AUW120D型電子分析天平：日本SHI－MADAU公司；迷你雙垂直電泳槽、轉(zhuǎn)印系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；Epoch 酶標(biāo)儀：美國 Bio-Tek；EPICS XL-MCL流式細(xì)胞儀：美國BECKMAN COULTER公司。

1.3 方法

1.3.1 黃皮果果核揮發(fā)油（essential oil of kernel，EOK）的提取與分離

稱取一定量黃皮果核，加水浸泡后采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，冷卻后收集揮發(fā)油。采用冷凍結(jié)晶法分離得到液態(tài)揮發(fā)油。通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 分析顯示，在EOK中檢測到33種化合物，其主要化合物是烯醇類，主要成分含量占56.74%。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

B16-F10細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80%左右時，按1∶3或1∶2傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗。

1.3.3 MTT法檢測細(xì)胞存活率

取對數(shù)生長期的細(xì)胞以3.5×103個/孔均勻接種于96孔板，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的 EOK（0.2、0.4、0.6、0.8 μL/mL），空白組加入等量生理鹽水，每組6個復(fù)孔，分別孵育24、48、72 h 后吸取上清液，每孔加入 MTT（5 g/L）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，隨后小心吸出培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL/孔溶解甲鐕，振蕩搖勻，結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀于波長570 nm處測量各孔的吸光度（OD值），并計算細(xì)胞抑制率。

1.3.4 觀察細(xì)胞形態(tài)

取對數(shù)生長期的細(xì)胞以2×104個/孔均勻接種于12孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，將培養(yǎng)基更換為不同濃度的含EOK培養(yǎng)基，在37℃孵育24 h后，將培養(yǎng)液更換為適量的PBS，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5 細(xì)胞凋亡檢測

取對數(shù)生長期的細(xì)胞以5×104個/孔均勻接種于6孔板，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。將培養(yǎng)基更換為不同濃度的含EOK培養(yǎng)基，37℃孵育24 h后，用胰酶消化收集細(xì)胞于1.5 mL試管中，在4℃、2 000 r/min條件下離心5 min，棄去上清液，用PBS洗滌2遍。細(xì)胞懸浮于500 μL的緩沖液中，添加5 μL磷脂酰絲氨酸蛋白抗體并混勻，再加入碘化丙啶試劑10 μL，室溫避光反應(yīng)15 min，然后在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.6 線粒體膜電位的檢測

取對數(shù)生長期的細(xì)胞以5×104個/孔均勻接種6孔板，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。將培養(yǎng)基更換為不同濃度的EOK培養(yǎng)基，37℃孵育24 h后，用無血清培養(yǎng)基洗滌1次，加入稀釋好的Rh123工作液（20 μmol/L）1 mL，置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育20 min，PBS洗滌3次，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.7 蛋白免疫印跡試驗

RIPA裂解液按試劑盒說明書要求裂解細(xì)胞，分離上清液，即細(xì)胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜。將印跡的聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）依次進(jìn)行封閉、加入對應(yīng)的一抗、二抗、抗體結(jié)合區(qū)帶加入電化學(xué)發(fā)光顯色液，掃描后保存。以β-actin為內(nèi)參，分析各組細(xì)胞目的蛋白相對表達(dá)量。

1.3.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 黃皮果果核揮發(fā)油對小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞增殖抑制的影響

通過MTT法檢測EOK對小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10細(xì)胞的抗增殖活性，結(jié)果如圖1所示。

圖1 EOK對B16-F10細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of EOK on the growth of B16-F10 cells

當(dāng)揮發(fā)油濃度為0.2 μL/mL，作用24 h后，對小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞的抑制率為（5.67±3.25）%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；當(dāng)作用48、72 h后，抑制率分別為（44.65±3.96）%、（53.39±4.70）%（P＜0.01）。當(dāng)藥物濃度分別為0.4、0.6、0.8 μL/mL時，隨著作用時間的增加，細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，且呈現(xiàn)濃度依賴性和時間依賴性。由此可見，EOK對小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用。

2.2 黃皮果果核揮發(fā)油對細(xì)胞形態(tài)影響

EOK處理24 h對B16-F10細(xì)胞形態(tài)變化的影響結(jié)果見圖2。

圖2顯示，對照組細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好，緊密排列，呈不規(guī)則梭形（圖2A）；與對照組相比，EOK作用24 h后，0.2 μL/mL、0.4 μL/mL 組細(xì)胞變長，細(xì)胞間隙增大，呈現(xiàn)樹突網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且有黑色顆粒物；隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞形態(tài)也驟變，0.8 μL/mL細(xì)胞體積明顯縮小，呈現(xiàn)固縮的圓形結(jié)構(gòu)，黑色顆粒物不明顯，漂浮在細(xì)胞培養(yǎng)液中的細(xì)胞增多。從形態(tài)方面預(yù)示著B16-F10細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)。

圖2 EOK處理24 h對B16-F10細(xì)胞形態(tài)變化的影響Fig.2 EOK deal with the effect of 24 h on the morphological changes of B16-F10 cells

圖3 Annexin V-FITC/PI雙染的流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率Fig.3 Apoptosis rate of B16-F10 cells detected by flow cytometric analysis

2.3 黃皮果果核揮發(fā)油對B16-F10細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-FITC染色觀察B16-F10細(xì)胞凋亡情況見圖3。

細(xì)胞凋亡的檢測方法有很多中，各有其特點。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，具有快速、靈敏度高、可以定量等優(yōu)點。其中Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記染色最為常用。磷脂酰絲氨酸（phasphatidylserine，PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，由于細(xì)胞膜失去對稱性，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。磷脂結(jié)合蛋白V（Annexin V）是一種鈣依賴的磷脂結(jié)合蛋白，它與PS高親和力特異性結(jié)合。熒光素FITC標(biāo)記的Annexin V可作為探針檢測暴露在細(xì)胞膜外側(cè)的的PS，指示凋亡細(xì)胞，但壞死細(xì)胞PS也會顯露在外表使Annexin V-FITC結(jié)合成陰性，必須加入碘化丙啶（propidiun iodide，PI）才能區(qū)分壞死細(xì)胞[13-14]。碘化丙啶是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能通過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核著色。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，與對照組（圖3A）比較，隨著EOK濃度的增加，凋亡比例也隨著增加，其誘導(dǎo)B16-F10細(xì)胞凋亡率分別為5.66%、30.34%、36.04%。這表明EOK能誘導(dǎo)B16-F10細(xì)胞凋亡。

2.4 黃皮果果核揮發(fā)油對B16-F10細(xì)胞線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）的影響

羅丹明123（rhodamine 123）是一種可透過細(xì)胞膜的陽離子熒光染料，是一種線粒體跨膜電位的指示劑。其在正常細(xì)胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì)，熒光強(qiáng)度減弱或消失。而在凋亡發(fā)生時，線粒體膜完整性破壞，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，引起線粒體跨膜電位（ΔΨm）的崩潰，Rh123重新釋放出線粒體，從而發(fā)出強(qiáng)黃綠色熒光，因此可以根據(jù)相對熒光信號的強(qiáng)度來衡量MMP的變化[15]。熒光染色法檢測B16-F10細(xì)胞線粒體膜電位水平見圖4。

圖4 熒光染色法檢測B16-F10細(xì)胞線粒體膜電位水平Fig.4 Detection of mitochondrial membrane potential level of B16-F10 cells by fluorescent staining

從圖4中可以看出，EOK處理24 h后，與對照組比較，藥物處理組細(xì)胞內(nèi)的熒光明顯增強(qiáng)，而且隨著濃度增大而增強(qiáng)，高濃度組所發(fā)熒光非常顯著，說明線粒體膜完整性可能已破壞，引起ΔΨm的崩潰，并隨藥物濃度的不同而使MMP出現(xiàn)不同程度的受損。結(jié)果表明EOK誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與抑制線粒體膜電位密切相關(guān)。

2.5 黃皮果果核揮發(fā)油對B16-F10細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

NF-κB是一類具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，在細(xì)胞胞漿內(nèi)是以無活性形式存在，通過I-B激酶（IK）激活后，受抑制的NF-κB得以釋放，發(fā)生核移位，在核內(nèi)積累并與特異性的B序列相結(jié)合啟動轉(zhuǎn)錄。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的下調(diào)，可促使與抗凋亡相關(guān)的NF-κB靶基因如TNF受體相關(guān)因子1等表達(dá)減弱，從而促進(jìn)凋亡。NF-κB也可調(diào)控Bcl-2家族中兩個抗凋亡蛋白：Bfl-1/A1、Bcl-X1的表達(dá)，也誘導(dǎo)Bcl-2和抑制Bax基因表達(dá)[16-17]。而Bcl-2與Bax這兩種蛋白參與構(gòu)成線粒體通路，分別具有抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，Bax/Bcl-2蛋白比值決定了細(xì)胞的生存和死亡。凋亡通路相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax/caspase 3被激活，Bax/Cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)增加，而Bcl-2蛋白被抑制，是經(jīng)典的線粒體凋亡途徑[18]。

EOK 對 B16-F10 細(xì)胞 NF-κB（P-P65）、NF-κB（P65）蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖5。

圖5 EOK 對 B16-F10 細(xì)胞 NF-κB（P-P65）、NF-κB（P65）蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of EOK on NF-κB（P-P65）and NF-κB（P65）protein expression in B16-F10 cells

從圖5中可以看出，與對照組相比，隨著黃皮果果核揮發(fā)油濃度的增加，NF-κB（P-P65）與 NF-κB（P65）蛋白表達(dá)均下調(diào)，其中在濃度0.2 μL/mL作用下蛋白表達(dá)量有所減少（P＜0.01）；且對 NF-κB（P65）蛋白表達(dá)的抑制作用比對NF-κB（P-P65）蛋白表達(dá)的抑制作用更為明顯。同時檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖6所示。

圖6 EOK對B16-F10細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of EOK on Bax and Bcl-2 protein expression in B16-F10 cells

與對照組相比，隨著果核揮發(fā)油濃度的增大，Bax蛋白表達(dá)增多，其中0.4、0.8 μL/mL組尤為明顯（P＜0.05或 P＜0.01）；而 Bcl-2 蛋白表達(dá)在 0.8 μL/mL 組減少尤為明顯（P＜0.01）。通過統(tǒng)計，Bax/Bcl-2的比值增大，0.4、0.8 μL/mL組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

對B16-F1細(xì)胞Cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖7。

圖7 EOK對B16-F10細(xì)胞Cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of EOK on Cleaved-caspase 3 protein expression in B16-F10 cells

如圖7所示，黃皮果果核揮發(fā)油也能上調(diào)Cleaved-caspase 3蛋白的表達(dá)。與對照組相比，0.4、0.8 μL/mL 組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。這些結(jié)果表明，線粒體途徑參與黃皮果果核揮發(fā)油誘導(dǎo)B16-F10細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與抑制胞內(nèi)NF-кB P65蛋白表達(dá)，降低其磷酸化水平，激活Bcl-2/Bax/caspase 3信號通路有關(guān)。

3 結(jié)論

水蒸氣蒸餾法提取的黃皮果核揮發(fā)油作用于小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞后，MTT法測定藥物濃度≥0.2 μL/mL時，黃皮果核揮發(fā)油對B16-F10細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。Annexin V-FITC/PI染色結(jié)果表明，在黃皮果核揮發(fā)油作用24 h后，0.8 μL/mL組凋亡細(xì)胞的比例高達(dá)36.06%。在羅丹明123染色檢測黃皮果核揮發(fā)油對B16-F10細(xì)胞線粒體膜電位有顯著影響，且隨著藥物濃度增大，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。蛋白免疫印跡結(jié)果表明，黃皮果核揮發(fā)油能下調(diào)NF-κB（PP65）、NF-κB（P65）、Bcl-2 的表達(dá)，同時上調(diào) Bax、Cleaved-caspase 3的表達(dá)。因此，試驗結(jié)果表明：黃皮果果核揮發(fā)油以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式抑制小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞增殖，其機(jī)制與抑制胞內(nèi)NF-кB P65蛋白表達(dá)，降低其磷酸化水平，激活Bcl-2/Bax/caspase 3信號通路有關(guān)。