郁林娜，程盛勇，付洋，魯文琴，劉興賦，羅喜榮，*，楊軍

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州貴陽(yáng)550004；3.中國(guó)科學(xué)院地球化學(xué)研究所，貴州貴陽(yáng)550081）

檸檬苦素類化合物是存在于蕓香科和楝科植物中的四環(huán)三萜類次生代謝產(chǎn)物，在柑橘類果實(shí)的核、內(nèi)果皮和囊衣等部位均有分布，以果核中含量最高（1%左右），主要為檸檬苦素、諾米林和黃柏酮，是引起柑橘味苦的重要原因之一。檸檬苦素類化合物可增強(qiáng)體內(nèi)谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）的活性，能抑制由化學(xué)物質(zhì)引起的口腔癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等腫瘤，具有鎮(zhèn)痛消炎、抗瘧、抗焦慮、抗高血壓、抗菌、抗病毒、殺蟲等作用，被認(rèn)為是潛在的防癌劑，作為功能性食品配料和醫(yī)藥原料具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景[1-7]。

目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)檸檬苦素的提取研究較多，鮮見諾米林的提取研究報(bào)道，尚未見檸檬苦素、諾米林和黃柏酮同時(shí)提取的文獻(xiàn)報(bào)道[8-16]。本文以檸檬苦素、諾米林和黃柏酮總得率為響應(yīng)指標(biāo)，采用Box-behnken響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取工藝，以期為檸檬苦素類化合物的開發(fā)利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橘核：產(chǎn)自浙江懼州，粉碎并過60目篩，30倍量石油醚回流脫脂后干燥備用；檸檬苦素、諾米林標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞98%）：貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)室自制；黃柏酮標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)116A022，純度＞98%）：北京索萊寶科技有限公司；乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

Agilent 1290 DAD超高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；UC-10H加熱超聲波清洗器：上海泰坦科技股份有限公司；SHZ-C水浴恒溫振蕩器：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；BSA224S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檸檬苦素類成分的含量測(cè)定

1.2.1.1 色譜條件

色譜柱：UItimate AQ-C18（2.1 mm×100 mm）；流動(dòng)相：乙腈-水（45∶55，體積比）；柱溫：30℃；流速：0.21 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：0.8 μL。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

取檸檬苦素、諾米林、黃柏酮標(biāo)準(zhǔn)品適量置10 mL量瓶，加甲醇溶解、定容，制得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，采用逐級(jí)稀釋法配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按“1.2.1.1”項(xiàng)下條件檢測(cè)。

1.2.1.3 供試品溶液制備

取橘核粉3.00 g置100 mL具塞錐形瓶，加入溶劑混勻、稱重，于不同溫度下超聲輔助提取一定時(shí)間后冷卻、稱重并補(bǔ)足減失的重量、過濾。取供試品溶液按“1.2.1.1”項(xiàng)下條件檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定檬苦素、諾米林、黃柏酮濃度，計(jì)算檸檬苦素類成分總得率Y=Y1+Y2+Y3。

1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以檸檬苦素類成分總得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，固定其他條件不變，分別考察不同提取溶劑（石油醚、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、異丙醇、無(wú)水乙醇、95%乙醇、甲醇、乙腈、水）、提取時(shí)間（10 min～90 min）、提取溫度（20 ℃～60 ℃）、液料比[5 ∶1（mL/g）～25 ∶1（mL/g）]對(duì)檸檬苦素類成分提取的影響，確定工藝優(yōu)化取值范圍。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取時(shí)間、提取溫度、液料比為考察因素，以檸檬苦素類成分總得率Y/（mg/g）為響應(yīng)指標(biāo)，采用Box-behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)方案優(yōu)化工藝條件，見表1。

表1 試驗(yàn)因素編碼及水平Table 1 Code and level of experimental factors

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬苦素類成分的含量測(cè)定

2.1.1 專屬性

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液按“1.2.1.1”項(xiàng)下條件檢測(cè)，結(jié)果見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品（A）和供試品（B）超高效液相色譜圖Fig.1 Ultra performance liquid chromatograms of reference substances（A）and sample（B）

由圖1可知檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的保留時(shí)間分別為3.07、3.95、5.54 min，各色譜峰完全分離且無(wú)雜質(zhì)峰干擾，表明方法專屬性良好。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的回歸方程分別為：Y1=1.965 5X-13.268 0（3.71 μg/mL～1 900 μg/mL，R2=0.999 5）；Y2=1.786 1X-9.153 2（2.93 μg/mL～1500 μg/mL，R2=0.9998）；Y3=4.5880X-40.0650（3.71μg/mL～950μg/mL，R2=0.9994）。

2.2 單因素試驗(yàn)

提取溶劑、提取時(shí)間、提取溫度和液料比對(duì)檸檬苦素類成分總得率的影響見圖2。

圖2 各因素對(duì)檸檬苦素類成分總得率的影響Fig.2 Effects of each factor on extraction yield of three limonoids constituents in citrus seed

由圖2可知，以甲醇作提取溶劑時(shí)，檸檬苦素類成分總得率最高；隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)、提取溫度升高、液料比增加，檸檬苦素類成分總得率均先增幅明顯，隨之變緩并趨于平穩(wěn)，說明目標(biāo)物質(zhì)的溶出基本完全，故確定提取時(shí)間、提取溫度、液料比的最佳取值范圍分別為10 min～50 min、20 ℃～40 ℃、5 ∶1（mL/g）～15 ∶1（mL/g）。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 試驗(yàn)結(jié)果及回歸模型分析

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2，回歸模型的方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 2 Experimental design and results of response surface

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for fitted quadratic polynomial model

應(yīng)用Design Expert 10.0.7軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行完全二次方程擬合，得檸檬苦素類成分總得率的回歸方程：Y=-11.127 7+0.233 4A+0.695 8B+1.097 6C-0.002 3AB+0.004 4AC-0.000 3BC-0.002 7A2-0.009 2B2-0.0505C2。由表3可知模型P＜0.01，表明該模型極顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05不顯著，說明試驗(yàn)誤差??；R2=0.988 3，R2Adj=0.967 2，表明該模型擬合度良好；A、B、C 和 A2、B2、C2對(duì)檸檬苦素類成分提取影響極顯著，AB、AC對(duì)檸檬苦素類成分提取影響顯著。

2.3.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

采用Design Expert 10.0.7軟件繪制響應(yīng)面圖和等高線圖，見圖3。

由圖3響應(yīng)面圖可知液料比對(duì)檸檬苦素類成分提取影響最為顯著，表現(xiàn)為曲面較陡，提取時(shí)間影響次之，提取溫度相對(duì)影響最??；由圖3等高線圖可知，提取時(shí)間和提取溫度交互作用對(duì)檸檬苦素類成分提取影響最大，表現(xiàn)為等高線呈較扁的橢圓形，提取時(shí)間和液料比交互作用影響次之，提取溫度和液料比交互作用影響較小。通過Design Expert 10.0.7軟件分析，得到檸檬苦素類成分最佳提取工藝條件：提取時(shí)間39.99 min、提取溫度 32.56℃、液料比 12.54 ∶1（mL/g）。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為方便實(shí)際操作將最佳提取工藝參數(shù)調(diào)整為提取時(shí)間 40 min、提取溫度 33℃、液料比 13∶1（mL/g），經(jīng)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，檸檬苦素類成分平均總得率為11.804 5 mg/g，與模型預(yù)測(cè)值11.756 9 mg/g的偏差為0.404 9%，表明該模型預(yù)測(cè)性良好，具有實(shí)用價(jià)值。取優(yōu)化條件供試品溶液回收甲醇得干燥品，按“1.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)得檸檬苦素類物質(zhì)純度72.642 5%，其中檸檬苦素36.599 4%、諾米林29.662 8%、黃柏酮6.380 3%，表明基于該工藝可有效獲得高純度檸檬苦素類化合物。

圖3 各因素對(duì)檸檬苦素類成分總得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.3 Responsive surface and contour of effects of each factor on extraction yield of three limonoids constituents in citrus seed

3 結(jié)論

我國(guó)柑橘資源豐富，其產(chǎn)量居世界首位，但柑橘加工業(yè)還十分落后，大量的副產(chǎn)物沒有合理利用，特別是橘核由于味苦，通常被當(dāng)作生活垃圾丟棄。若能高效合理地提取檸檬苦素類化合物，并將其投至食品醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展，將會(huì)帶來(lái)顯著的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

超聲輔助提取是常用的中藥提取方法，具有快速、高效、環(huán)保，且設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便等特點(diǎn)[17]。本文應(yīng)用響應(yīng)面法首次建立了橘核中3種檸檬苦素類成分的超聲輔助提取方法，得到優(yōu)化提取工藝條件為甲醇作提取溶劑、提取時(shí)間40 min、提取溫度33℃、液料比13∶1（mL/g），此條件下檸檬苦素類成分總得率為11.804 5 mg/g，產(chǎn)物中檸檬苦素類物質(zhì)純度高，有利于檸檬苦素、諾米林和黃柏酮的后續(xù)單體純化，對(duì)其新型保健食品和新藥研發(fā)有重要意義。本工藝具有經(jīng)濟(jì)、高效、合理、重復(fù)性好等特點(diǎn)，用于柑橘果實(shí)中檸檬苦素類化合物的提取切實(shí)可行，為檸檬苦素類化合物的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。