張曉安 蘭碧洋 羅 強

(廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院/廣西醫(yī)科大學附屬民族醫(yī)院胸心外科，南寧市 530001，電子郵箱：753972@qq.com)

食管癌是臨床較為常見的惡性腫瘤，占食管腫瘤的90%以上[1]。食管癌起病隱匿，多數(shù)患者就診時已處于中晚期，而目前臨床對晚期食管癌的治療尚缺乏有效手段[2]。手術(shù)結(jié)合放化療可大大提高早期食管癌患者的治愈率，但對于晚期食管癌患者，其術(shù)后5年生存率僅為20%左右[3]。因此，尋找食管癌的早期診斷標記物對食管癌的臨床診療具有重要意義。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度為18～24 bp的內(nèi)源性小RNA，其在多種組織中均有表達。微小RNA-320屬于腫瘤抑制miRNA，可通過抑制腫瘤細胞的增殖、腫瘤組織血管形成從而抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[4]。文獻報道，微小RNA-320在結(jié)直腸癌[5]、宮頸癌[6]等腫瘤組織中表達異常，但關于微小RNA-320在食管癌組織中的表達及其臨床意義的研究較少。因此，本研究檢測并對比食管癌患者癌組織及癌旁正常組織中微小RNA-320的表達水平，探討微小RNA-320表達水平與食管癌患者病理特征的相關性，并分析微小RNA-320與食管癌患者預后的關系，以期為食管癌的臨床診療提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織樣本 收集2012年6月至2014年6月間我院收治的100例食管癌患者的食管癌組織和對應癌旁正常組織(距癌組織邊緣≥1 cm)樣本。所有患者的臨床病理資料均完整；食管癌組織均經(jīng)病理檢查證實為原發(fā)性食管癌，癌旁組織樣本均經(jīng)病理證實為正常食管組織；患者手術(shù)前均未接受放療或化療。所有樣本均通過手術(shù)獲取，經(jīng)生理鹽水清洗后液氮速凍，置于-80℃冰箱中保存待檢。100例食管癌患者中，男性53例，女性47例；年齡28～74(53.64±2.95)歲；胸上段食管癌19例，胸中段食管癌53例，胸下段食管癌28例；低分化21例，中分化32例，高分化47例；原發(fā)腫瘤-區(qū)域淋巴結(jié)-遠處轉(zhuǎn)移(tumor-node-metastasis,TNM)分期：Ⅰ期24例、Ⅱ期38例、Ⅲ期27例、Ⅳ期11例；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例。

1.2 主要試劑與儀器 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：1321067)、實時定量PCR試劑盒(批號：4427368)、7500型實時定量PCR儀均購自美國ABI公司；TRIzol試劑(批號：15596026)購自美國Invitrogen公司；SmartSpec Plus分光光度計購自Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設計：采用Primer premier 6.0軟件設計引物，并委托上海生工生物工程有限公司進行合成。微小RNA-320上游引物序列為5′-CACATCACGCTGAAAGGGCAGTGGGATTGA-3′，下游引物序列為5′-CACATAGCCCTCGCTGGGACTC-3′；內(nèi)參U6上游引物序列為5′-CCTGCGGCTTCGACACA-3′，下游引物序列為5′-ACAGCTTCGCTTTAAACGGT-3′；微小RNA-320逆轉(zhuǎn)錄引物序列為5′-ATACCCTGGTCGTGTGGTAGCAACGGTTCTTAGGAGTCCGCCCT-3′；內(nèi)參U6逆轉(zhuǎn)錄引物序列為5′-ACGTTCAAACGTTTGTGCCATGT-3′。

1.3.2 樣本總RNA提取：取5 g樣本組織超聲勻漿，按TRIzol試劑盒說明書提取組織中總RNA，采用分光光度計檢測RNA純度及濃度；取1μL RNA行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，將電泳條帶清晰者用于實時定量PCR檢測。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄反應：按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應，反應體系為20 μL。于0.1 mL EP管中分別加入10×RT buffer 1.5 μL、1 μmol/L逆轉(zhuǎn)錄特異性引物3 μL、100 mmol/L dNTPs 0.15 μL、20 U/μL RNA酶抑制劑0.19 μL、50 U/μL MultiScribeTMReverse Transcriptase 1.0 μL、RNA樣品 1 μL，然后加焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水補至20 μL。反應條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 s；反應后產(chǎn)物置于-20℃保存。

1.3.4 實時定量PCR反應：按照PCR試劑盒操作說明書進行操作，反應體系為20 μL，包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 1 μL、TaqMan GEx Master Mix 10 μL、引物1 μL、DEPC水8 μL。反應條件：95℃ 10 min；92℃ 15 s，60℃ 1 min；40個循環(huán)。采用相對表達量法計算微小RNA-320表達水平，以2-△Ct表示癌組織及癌旁組織中微小RNA-320的相對表達量，△Ct=CtmiR-320-CtU6。

1.4 隨訪 隨訪根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟推薦指南，于食管癌患者手術(shù)當月開始，術(shù)后第1年每3個月隨訪1次，術(shù)后第2年及第3年每半年隨訪1次，隨訪期限為36個月，隨訪截止時間為2017年6月。隨訪期內(nèi)以患者死亡為隨訪終止事件，患者術(shù)后出現(xiàn)復發(fā)和(或)轉(zhuǎn)移判定為病情惡化。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用M(P25，P75)表示，組間比較秩和檢驗。采用Kaplan-Meier生存曲線、log-rank檢驗和Cox回歸模型分析微小RNA-320表達水平與患者預后的關系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 微小RNA-320的表達水平與臨床病理特征的關系 食管癌組織中微小RNA-320的相對表達量為0.57(0.41,0.68)，低于癌旁正常組織的1.19(0.83，1.37)(z=9.394，P<0.001)。食管癌組織中微小RNA-320的表達水平與患者的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤程度有關(均P<0.05)。見表1。

2.2 食管癌組織中微小RNA-320的表達水平與患者預后的關系 所有研究對象均獲隨訪，中位隨訪時間為19個月，隨訪期內(nèi)有74例患者出現(xiàn)病情惡化，有9例患者死亡。參照文獻[7]，以微小RNA-320中位相對表達水平0.4為截斷值區(qū)分表達高低(≥0.40為高表達，<0.40為低表達)。微小RNA-320高表達者中位生存時間為23個月(95%CI：19.2～25.3)，微小RNA-320低表達者中位生存時間為11個月(95%CI：9.5～13.7)；經(jīng)log-rank法檢驗，微小RNA-320高表達者中位生存時間高于低表達者(χ2=3.194，P=0.027)，見圖1。以食管癌患者的年齡、性別、臨床病理特征為自變量，生存狀態(tài)和生存時間為因變量，納入Cox回歸多因素模型分析；結(jié)果顯示，微小RNA-320表達水平是食管癌患者預后的獨立影響因素(P<0.05)。見表3。

圖1 不同微小RNA-320表達水平患者的Kaplan-Meier生存曲線圖

3 討 論

miRNA廣泛存在于真核生物中，且存在形式多樣，目前已在動植物及病毒中發(fā)現(xiàn)28645個miRNA 分子，其主要以基因簇、單拷貝或多拷貝等形式存在[8-9]。正常生理狀態(tài)下，機體內(nèi)miRNA表達遵守嚴格的組織、時序特異性；但在腫瘤環(huán)境下，往往出現(xiàn)miRNA的異常表達[10]。既往研究表明，miRNA不僅對分子靶信使RNAs(messenger RNAs,mRNAs)的轉(zhuǎn)錄及翻譯有抑制作用，還可促進mRNAs降解，從而調(diào)控細胞的代謝、增殖、分化及凋亡等，尤其在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中起到關鍵作用[11]。研究證實，食管癌中存在多種miRNA的異常表達，提示miRNA參與食管癌的發(fā)生與發(fā)展[12]。因此，深入研究miRNA與食管癌之間的關系對其臨床診療具有重要作用。微小RNA-320是新發(fā)現(xiàn)的miRNA，定位于人類第8號染色體。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-320在多種惡性腫瘤組織中表達異常，其失衡表達可促進惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，發(fā)揮著類似于抑癌基因的作用[13-15]，但關于微小RNA-320在食管癌組織中的表達研究報道較少。

本研究通過檢測食管癌組織和對應癌旁正常組織中微小RNA-320的表達水平，發(fā)現(xiàn)微小RNA-320在食管癌組織中的表達低于癌旁正常組織(P<0.05)，該結(jié)果與其他腫瘤中微小RNA-320的表達情況相似[16-17]，這說明微小RNA-320的低表達可能在某種程度上促進食管癌的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，不同分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及浸潤程度的食管癌患者中微小RNA-320的表達水平不同(均P<0.05)，即微小RNA-320表達越低，腫瘤分化程度越低，TNM分期越高，浸潤程度越深，也越容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示微小RNA-320作為抑癌基因可能參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及遷移等過程。此外，生存分析結(jié)果顯示，微小RNA-320低表達者中位生存時間短于微小RNA-320高表達者，提示微小RNA-320低表達與食管癌患者預后不良有關，上調(diào)微小RNA-320的表達水平可能有助于改善食管癌患者的預后，延長患者的生存時間。本研究中微小RNA-320表達水平與食管癌患者年齡、性別、腫瘤部位及腫瘤直徑等臨床病理特征無明顯關系，這說明微小RNA-320的表達不易受個體因素或其他因素影響，結(jié)合生存分析結(jié)果，我們認為其可能是食管癌早期診斷及療效判定的潛在生物學標記物。因此，重視食管癌組織中微小RNA-320的檢測，有助于判斷食管癌及其組織學進展，可為臨床治療方式的選擇提供參考。

綜上所述，微小RNA-320在食管癌組織中呈低表達，且與食管癌分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、浸潤程度及患者預后有關，提示微小RNA-320或許可作為食管癌臨床治療的新靶點及預后評價的一個指標。今后應增加樣本量，對微小RNA-320與食管癌的發(fā)生發(fā)展進行深入研究，以期為臨床診治及預后評估提供更有意義的參考依據(jù)。