蔣雯雯， 柳婷婷， 董雙林,2， 田相利,2??， 李 麗,2， 蔡玉勇， 李海東， 趙 坤

(1 .海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003; 2 .青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266235)

循環(huán)水養(yǎng)殖是一種通過(guò)對(duì)系統(tǒng)內(nèi)養(yǎng)殖廢水進(jìn)行一系列物理、化學(xué)和生物處理，經(jīng)處理后的水可以被再度用于養(yǎng)殖活動(dòng)的新型養(yǎng)殖模式。循環(huán)水養(yǎng)殖因具有污水排放少、水資源利用率高、可以降低外來(lái)疾病引入風(fēng)險(xiǎn)、能夠進(jìn)行精準(zhǔn)的養(yǎng)殖自動(dòng)化管理等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖活動(dòng)[1]。在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，采用生物濾池實(shí)現(xiàn)氮元素從高毒害向低毒害的轉(zhuǎn)換，是水處理的核心技術(shù)之一[2]。生物濾池的有效運(yùn)轉(zhuǎn)，需要在濾料表面形成生物膜，建立能有效去除氨氮和亞硝酸氮等有害污染物的菌群結(jié)構(gòu)[3]，而養(yǎng)殖活動(dòng)中的溫度、鹽度、投喂量、水交換量以及日常管理等會(huì)直接影響硝化菌群的建立及其硝化效率[4-6]。因此，對(duì)于新建成的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，確保生物膜成熟并具有穩(wěn)定凈化效果是系統(tǒng)早期運(yùn)行的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

受實(shí)驗(yàn)條件的限制，對(duì)生物濾池的研究大部分僅限于室內(nèi)的小規(guī)模模擬實(shí)驗(yàn)，少有從商業(yè)規(guī)模養(yǎng)殖系統(tǒng)中取得研究數(shù)據(jù)[7-8]，而從商業(yè)規(guī)模養(yǎng)殖系統(tǒng)中獲得的數(shù)據(jù)，可以更好得用于系統(tǒng)的優(yōu)化和設(shè)計(jì)[9]。另外，多數(shù)研究限于20 ℃以上的常溫和高溫系統(tǒng)[3, 10-11]，對(duì)于低溫冷水魚(yú)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的研究較少。同時(shí)，為維持并提高生物濾池的水處理效率，不少學(xué)者嘗試從不同介質(zhì)上分離得到具有高效降解氨氮和亞硝酸氮功能的細(xì)菌[12-13]，然后將這些分離得到的細(xì)菌制成微生態(tài)制劑添加到生物濾料上，發(fā)現(xiàn)可有效提高生物濾料的水處理效率[14]。

本文以新建成的商業(yè)規(guī)模的冷水魚(yú)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的生物濾池為研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)定各類(lèi)水質(zhì)指標(biāo)，探究生物濾池的成熟過(guò)程和水處理效果，旨在了解商業(yè)規(guī)模下低溫循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中生物膜的成熟周期和凈化規(guī)律，為今后類(lèi)似系統(tǒng)生物濾池的管理和設(shè)計(jì)提供借鑒。同時(shí)對(duì)成熟生物濾料進(jìn)行了低溫氮降解細(xì)菌的富集和分離，以期獲得可有效降解養(yǎng)殖廢水中氨氮和亞硝酸氮的細(xì)菌，用于后續(xù)添加至生物濾料上以提高生物膜構(gòu)建速度和水處理效率。

1 材料與方法

1.1 系統(tǒng)組成及運(yùn)行

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)位于山東省日照市，主要養(yǎng)殖硬頭鱒(Oncorhynchusmykiss)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)等冷水性魚(yú)類(lèi)，養(yǎng)殖總量為35 000尾，魚(yú)規(guī)格為40 g，日投喂量按魚(yú)體重的1.5%。系統(tǒng)由養(yǎng)殖單元和水處理單元兩部分組成，養(yǎng)殖單元為26個(gè)容積16.96 m3的圓形養(yǎng)殖池，總養(yǎng)殖容積440.86 m3，水處理單元包括沉淀池、微濾池、生物濾池、紫外消毒池和曝氣池五部分(見(jiàn)圖1)，其中，生物濾池為6串聯(lián)浸沒(méi)式結(jié)構(gòu)，總?cè)莘e587.24 m3，濾料為立體彈性濾料，由聚乙烯纖維絲加工而成，直徑為0.5 mm，比表面積約為360 m2·m-3，形狀類(lèi)似日常使用的毛刷。生物填料布設(shè)完成后，使用魚(yú)池養(yǎng)殖廢水對(duì)生物濾池浸泡10 d，后開(kāi)啟循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，系統(tǒng)運(yùn)行期間日補(bǔ)水量10%，系統(tǒng)的水力停留時(shí)間約為1 h，日循環(huán)20次。

圖1 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水處理流程Fig.1 Water treatment process of recirculating aquaculture system

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2 低溫氮降解細(xì)菌的富集和分離 在第90天取生物膜已經(jīng)成熟的生物填料2 g，以震蕩方式將填料上的生物膜洗脫至100 mL無(wú)菌生理鹽水中，制得菌懸液。按照體積比為10∶1的接種量將菌懸液接種到不同的硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基中，置于15 ℃，160 r/min的條件下持續(xù)培養(yǎng)7 d，記為第一個(gè)富集周期，第一個(gè)富集周期結(jié)束后，將所得的富集菌液按相同方法接種、培養(yǎng)7 d，記為第二個(gè)富集周期，如此持續(xù)富集7個(gè)周期，富集期間取第4、5、6和7富集周期的菌液按照1∶10的接種量，接種至人工配制的降解液中，置于15 ℃，160 r/min的條件下連續(xù)測(cè)定5天內(nèi)富集菌液對(duì)氨氮和亞硝酸氮的降解效果，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。取降解效果好的富集菌液，涂布于相應(yīng)的富集培養(yǎng)基平板上，置于15 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單菌落后進(jìn)行分離、純化。

1.2.3 低溫氮降解細(xì)菌的降氮效果測(cè)定 將分離、純化得到的細(xì)菌于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600值為0.5時(shí)，調(diào)整菌液濃度為106后按照10%的接種量接種至人工配制的降解液中，置于15 ℃，160 r/min的條件下測(cè)定第3和5天各株細(xì)菌對(duì)氨氮和亞硝酸氮的降解效果，再根據(jù)每株細(xì)菌的降解效果進(jìn)一步選取降氮效果好的細(xì)菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 實(shí)驗(yàn)用富集培養(yǎng)基及降解液

低溫氮降解細(xì)菌的富集培養(yǎng)基主要參考李步先的研究[15]，以葡萄糖為碳源，并分別以氨氮和亞硝酸氮為綜合氮源以及氨氮、亞硝氮為單獨(dú)氮源，基礎(chǔ)配比如下：

MgSO40.1 g，NaH2PO4·2H2O 0.26 g，K2HPO40.5 g，CaCO31 g， FeSO4·7H2O 0.183 g，葡萄糖0.3或5.0 g(前3個(gè)周期所用葡萄糖添加量為0.3 g，后4個(gè)周期葡萄糖添加量為5.0 g)，酵母膏0.03 g，1 000 mL純水。

其中，N1富集培養(yǎng)基以添加2 g (NH4)2SO4、0.5 g NH4Cl和 1 g KNO2作為氮源，N2富集培養(yǎng)基以添加2 g (NH4)2SO4和0.5 g NH4Cl作為氮源，N3富集培養(yǎng)基以添加1 g KNO2作為氮源。

人工降解液參考李步先的研究[15]，具體配比如下：

0.2 g NH4Cl，0.2 g NaNO2，2 g葡萄糖，1 000 mL純水。

1.4 水質(zhì)指標(biāo)的檢測(cè)方法

氨氮、亞硝酸氮、總氮、活性磷和總磷的測(cè)定主要參考《養(yǎng)殖水環(huán)境化學(xué)實(shí)驗(yàn)》[16]，氨氮采用靛酚藍(lán)法，亞硝酸氮采用重氮-偶氮比色法，總氮和總磷采用消解法，活性磷采用磷鉬藍(lán)法，硝酸氮采用紫外分光光度法；總有機(jī)碳、總碳和總無(wú)機(jī)碳使用德國(guó)耶拿公司的總有機(jī)碳分析儀(2100S)測(cè)定，溫度和溶解氧使用手持溶氧儀AZ8403測(cè)定，pH使用筆試酸度計(jì)測(cè)定，鹽度使用手持式鹽度計(jì)測(cè)定，OD600值使用酶標(biāo)儀SYnergy2測(cè)定。

1.5 單株細(xì)菌對(duì)氨氮和亞硝酸氮的降解效率

單株細(xì)菌對(duì)氨氮和亞硝酸氮降解率(n)計(jì)算公式：

n= (C0-Cn)/C0×100%。

式中：n為降解率 (%)；C0為降解液中初始氨氮或亞硝酸氮濃度 (mg/L)；Cn為降解液中氨氮或亞硝酸氮的終濃度 (mg/L)。

1.6 細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定方法

用水煮法提取細(xì)菌的DNA，采用細(xì)菌16SrDNA的通用引物27F和1472R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后送至青島擎科天成生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0.0.0統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA進(jìn)行顯著性差異及均值多重比較(Duncan)，以P<0.05為差異顯著水平。

細(xì)菌測(cè)得的16SrDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)后，下載相似性大于97%的相關(guān)細(xì)菌序列，使用MEGA 7.0采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物濾池成熟過(guò)程中水質(zhì)變動(dòng)情況

2.1.1 系統(tǒng)內(nèi)水質(zhì)基本情況 在生物膜的培養(yǎng)和成熟過(guò)程中，生物濾池和魚(yú)池的水溫一直維持在18 ℃左右，pH穩(wěn)定在7.5～8.0，溶解氧的濃度維持在5 mg/L以上，鹽度均為(見(jiàn)表1)。

表1 系統(tǒng)內(nèi)水質(zhì)基本情況Table 1 Fundamental state of the water in the recirculating aquaculture system

注：如無(wú)特殊說(shuō)明，所有表格中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

Note: The data in all
Tables were presented as mean ± SD, unless specified.

① Temperature;②Dissolved oxygen ；③Salinity；④Biofilters effluent；⑤Fish pools effluent

2.1.2 系統(tǒng)內(nèi)氮的變化 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，氨氮、亞硝酸氮、硝酸氮和總氮濃度變化見(jiàn)圖2，前20 d內(nèi)(見(jiàn)圖2(a))，生物濾池出水和魚(yú)池出水的氨氮濃度顯著下降 (P< 0.05)，說(shuō)明生物濾料上附著的硝化細(xì)菌數(shù)量逐漸增加， 40 d以后，氨氮濃度基本穩(wěn)定在0.05 mg/L以下。生物濾池出水和魚(yú)池出水的亞硝酸氮濃度在前40 d內(nèi)均呈現(xiàn)先升高再降低的變動(dòng)特點(diǎn)(見(jiàn)圖2(b))，40 d后系統(tǒng)的亞硝酸氮的濃度也都穩(wěn)定在0.05 mg/L以下生物濾池出水和魚(yú)池出水的硝酸氮和總氮濃度在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)均顯著上升 (P<0.05) (見(jiàn)圖2(c)和2(d))。說(shuō)明生物濾池中的生物膜主要進(jìn)行的是將高毒的氨氮轉(zhuǎn)化為低毒的硝酸氮的硝化反應(yīng)，對(duì)于將硝酸氮轉(zhuǎn)化為NO或N2排出系統(tǒng)的反硝化作用則很少或沒(méi)有發(fā)生。綜合比較，40 d后，系統(tǒng)內(nèi)氨氮和亞硝酸氮的濃度基本保持穩(wěn)定，說(shuō)明濾料上的生物膜已經(jīng)完全成熟。

2.1.3 系統(tǒng)內(nèi)磷的變化 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，生物濾池出水和魚(yú)池出水的活性磷與總磷濃度的變化與硝酸氮和總氮的表現(xiàn)相似，均呈現(xiàn)顯著升高的趨勢(shì) (P<0.05) (見(jiàn)圖3(a)和3(b))，說(shuō)明生物濾池對(duì)活性磷和總磷的降解作用不顯著。

2.1.4 系統(tǒng)內(nèi)碳的變化 實(shí)驗(yàn)前60 d，生物濾池出水和魚(yú)池出水的總碳和無(wú)機(jī)碳濃度呈穩(wěn)步下降態(tài)勢(shì)，60 d后趨于穩(wěn)定(見(jiàn)圖4(c)和4(b))，說(shuō)明在生物膜成熟過(guò)程中也需要利用無(wú)機(jī)碳作為碳源，但總碳和無(wú)機(jī)碳在生物濾池出水中濃度的降低相對(duì)滯后，說(shuō)明利用無(wú)機(jī)碳為碳源的菌群的形成滯后于利用氮、磷的菌群。相應(yīng)的，與總碳和無(wú)機(jī)碳相比，從生物布設(shè)完成并開(kāi)始浸泡，生物濾池對(duì)有機(jī)碳有顯著降解作用(見(jiàn)圖4(a))。實(shí)驗(yàn)第0天，魚(yú)池出水中有機(jī)碳濃度為13 mg/L，經(jīng)過(guò)生物濾池的降解后，同期內(nèi)生物濾池出水中的有機(jī)碳濃度降低至4 mg/L。實(shí)驗(yàn)10 d后，系統(tǒng)開(kāi)啟循環(huán)運(yùn)行，由于生物濾池的降解作用，2個(gè)測(cè)試點(diǎn)水體中的有機(jī)碳濃度始終穩(wěn)定在7 mg/L以下。說(shuō)明生物濾料上最初形成的群落主要利用有機(jī)碳為碳源，并且在以后群落演替的過(guò)程中，利用有機(jī)碳為碳源的群落也不會(huì)消失。

2.2 低溫氮降解富集菌液的降氮效果測(cè)定

經(jīng)過(guò)4個(gè)周期的富集后(見(jiàn)圖5(a))，不同培養(yǎng)基富集的菌液對(duì)氨氮和亞硝酸氮均有較好的降解效果，特別是N3組的富集菌液，經(jīng)過(guò)5天的降解實(shí)驗(yàn)可以將降解液中的氨氮由最初的(36±3.21) mg/L降解至(20±7.13) mg/L (P<0.05)，將亞硝酸氮由最初的(44±0.79) mg/L顯著降解至(2±0.75) mg/L (P<0.05)，說(shuō)明之前采集到的生物濾料上確實(shí)已經(jīng)形成可以降解氨氮和亞硝酸氮的種群，并且在不斷的富集過(guò)程中，這類(lèi)種群已經(jīng)逐漸成為優(yōu)勢(shì)種群。經(jīng)過(guò)5個(gè)周期的富集后(見(jiàn)圖5(b))，N3組的富集菌液經(jīng)過(guò)5 d的降解實(shí)驗(yàn)可以將降解液中的氨氮由最初的(36±3.21) mg/L降解為(0.9±0.44) mg/L (P<0.05)，將亞硝酸氮由最初的(44±0.79) mg/L降解至(0.076±0.01) mg/L (P< 0.05)；N1和N2組的富集菌液經(jīng)過(guò)5 d的降解實(shí)驗(yàn)可以將亞硝酸氮降解至(0.034±0.01)和(0.046±0.01) mg/L (P<0.05)。經(jīng)過(guò)6個(gè)周期的富集后(見(jiàn)圖5c)，N3組的富集菌液在第4天已經(jīng)能將降解液中的氨氮和亞硝酸氮分別降解至(0.035±0.01)和(0.3±0.17) mg/L (P< 0.05)， N1和N2組的富集菌液也可以在第4天將降解液中的亞硝酸氮顯著降解至(0.25±0.02)和(0.63±0.24) mg/L (P<0.05)。經(jīng)過(guò)7個(gè)周期的富集后(見(jiàn)圖5(d))，N3組的富集菌液在第5天能將降解液中的氨氮和亞硝酸氮分別降解至(1.68±0.86)和(0.056±0.01) mg/L (P<0.05)， N1和N2組的富集菌液可以在第4天將降解液中的亞硝酸氮分別降解至(0.25±0.03)和(0.2±0.02)mg/L (P<0.05)。將第7周期各組富集菌液的降解效果與第6周期相比，到第5天，各組在2個(gè)周期間沒(méi)有顯著差異 (P>0.05)，說(shuō)明經(jīng)過(guò)6個(gè)周期富集的菌液即達(dá)到富集要求。

圖2 系統(tǒng)內(nèi)氨氮(a)、亞硝酸氮(b)、硝酸氮(c)和總氮(d)濃度變化情況Fig.2 Concentration changes of (a), (b), (c), TN (d) in the recirculating aquaculture system

圖3 系統(tǒng)內(nèi)活性磷(a)和總磷(b)濃度變化情況Fig.3 Concentration changes of (a) and TP (b) in the recirculating system

圖4 系統(tǒng)內(nèi)有機(jī)碳(a)、無(wú)機(jī)碳(b)和總碳(c)濃度變化情況Fig. 4 Concentration changes of TOC (a), TIC (b) and TC (c) in the recirculating aquaculture system

圖5 不同時(shí)期富集菌液對(duì)氨氮和亞硝酸氮的降解效果Fig. 5 Degradation effect to ammonia and nitrite among enrichment bacteria of different enriching periods

2.3 低溫氮降解細(xì)菌的降氮效果測(cè)定

實(shí)驗(yàn)分離得到14株耐低溫的細(xì)菌(見(jiàn)表2)，其中有4株細(xì)菌 (LB1-4、LB3-J、LB3-1和LB2-6) 經(jīng)過(guò)5 d的降解實(shí)驗(yàn)，可以將降解液中的氨氮由最初的36 mg/L分別降解至1.3、4.7、4.6和5.1 mg/L，降解率達(dá)96.39%、86.94%、87.22%和85.83%；有5株細(xì)菌 (LB1-4、LB3-J、LB3-1、LB3-3和LB2-6) 經(jīng)過(guò)5 d的降解實(shí)驗(yàn)，可以將降解液中的亞硝酸氮由最初的40 mg/L分別降解至0.22、0.02、0.03、0.03和0.01 mg/L，降解率達(dá)99.45%、99.95%、99.93%、99.93%和99.98%。

表2 不同菌株對(duì)氨氮和亞硝酸氮的降解效果Table 2 Degradation effect to ammonia and nitrite among different bacteria

注：字體加粗的為氨氮或亞硝酸氮降解效果較好的細(xì)菌。

Note: The bold font are the bacteria with better degradation effect of ammonia or nitrite.

2.4 低溫氮降解細(xì)菌的鑒定

將分離得到的LB1-4、LB3-J、LB3-1和LB2-6這4株細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)后，選取相似性達(dá)97%以上的細(xì)菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示(見(jiàn)圖6)，LB1-4為枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis)，LB3-J為Velezensis芽孢桿菌 (Bacillusvelezensisstrain SQ-5)，LB3-1為土芽孢桿菌 (Geobacillussp. strain SA2)，LB2-6為短小芽孢桿菌 (Bacilluspumilusstrain AB25A-SW1)。

3 討論

3.1 通過(guò)水質(zhì)變動(dòng)探究生物濾器成熟過(guò)程

生物濾池是循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的核心單元，主要功能是通過(guò)硝化作用將養(yǎng)殖廢水中有毒有害的氨氮和亞硝酸氮轉(zhuǎn)化為低毒害的硝酸氮。在生物濾池成熟過(guò)程中，可以根據(jù)生物濾料上生物膜的質(zhì)量以及氨氮的去除效果劃分為潛伏期、增長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和脫落期[3]；也可以根據(jù)生物濾料上的細(xì)菌數(shù)量將其成熟過(guò)程劃分為適應(yīng)期、潛伏期、快速增長(zhǎng)期和穩(wěn)定期[11]。但不管以怎樣的方式對(duì)生物濾池的成熟過(guò)程進(jìn)行界定，生物濾池成熟時(shí)最顯著的特征為具有穩(wěn)定的硝化作用，可以達(dá)到水質(zhì)凈化效果[3, 11, 17-18]。本研究中，經(jīng)過(guò)40 d的培養(yǎng)后，生物濾池和養(yǎng)殖魚(yú)池出水中的氨氮和亞硝酸氮濃度均基本穩(wěn)定，因此可以認(rèn)為本系統(tǒng)經(jīng)過(guò)40 d培養(yǎng)，生物濾池已經(jīng)達(dá)到成熟狀態(tài)。在此之前，許多研究指出溫度對(duì)硝化細(xì)菌的代謝影響顯著，在20 ℃以上水溫條件下，生物濾池成熟一般都需要30～40 d[3, 18]，在25 ℃的條件下，生物濾池有較好的氨氮去除效率[19]。而本次研究結(jié)果表明：在較低的水溫條件下 (17～18 ℃)，生物濾池40 d左右成熟，并在低溫下對(duì)氨氮、亞硝酸鹽實(shí)現(xiàn)有效去除。

圖6 4株低溫氮降解細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig. 6 Phylogenetic trees of 4 bacteria of nitrogen degradation bearing low temperature

生物膜是一個(gè)以硝化細(xì)菌為主的生物絮團(tuán)，同時(shí)還包括一些藻類(lèi)、真菌和原生動(dòng)物[20]。硝化作用主要分為兩個(gè)步驟，第一步為氨氮氧化為亞硝酸氮，第二步為亞硝酸氮進(jìn)一步氧化為硝酸氮[6]。其中，第一步主要由氨氧化細(xì)菌和氨氧化古生菌完成[21]，第二步主要由硝化菌屬和硝化螺旋菌屬細(xì)菌完成。本研究中，2個(gè)測(cè)試點(diǎn)的氨氮濃度在系統(tǒng)啟動(dòng)后表現(xiàn)為持續(xù)下降，而亞硝酸鹽濃度則表現(xiàn)為先升后降，硝酸鹽濃度持續(xù)上升，說(shuō)明氨氧化細(xì)菌和氨氧化古生菌的生長(zhǎng)要優(yōu)于硝化菌屬和硝化螺旋菌屬細(xì)菌的生長(zhǎng)，氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽的變化規(guī)律與許多學(xué)者的研究結(jié)果相似[18, 22]。硝化作用主要是將高毒害的氨氮氧化為低毒的硝酸氮，而硝酸鹽從系統(tǒng)的移除則主要依賴(lài)于反硝化反應(yīng)[23]，可以進(jìn)行反硝化反應(yīng)的細(xì)菌群落主要為厭氧細(xì)菌，較高的溶氧條件會(huì)阻礙反硝化菌群的附著和繁殖[24]，在本實(shí)驗(yàn)中硝酸氮濃度和總氮濃度的不斷升高，說(shuō)明在高溶氧的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，生物濾器可以實(shí)現(xiàn)高毒氨氮向低毒硝酸氮的轉(zhuǎn)變，但卻不能實(shí)現(xiàn)氮營(yíng)養(yǎng)鹽的移除。

餌料中磷的溶失是水體中磷含量升高的主要原因[25]。水體中磷的去除，通常需要一個(gè)厭氧的條件才能實(shí)現(xiàn)[26]。聚磷菌雖是好氧細(xì)菌，但其釋磷功能在厭氧條件下才能充分發(fā)揮[27]。而本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)溶解氧一直維持在6 mg/L以上，較高的溶氧抑制了聚磷菌釋磷功能的發(fā)揮，餌料中磷的不斷溶失，加之生物膜對(duì)磷較低的去除效率，最終導(dǎo)致水體中的活性磷和總磷濃度不斷升高，這一現(xiàn)象在其他相關(guān)研究中也有發(fā)現(xiàn)[25]。

水體中有機(jī)碳的濃度可以表征水體中有機(jī)物的含量，同時(shí)，有機(jī)碳源的添加可以改變一些人工基質(zhì)表面菌群結(jié)構(gòu)的組成，促進(jìn)異養(yǎng)菌的生長(zhǎng)[28]。本研究中，實(shí)驗(yàn)初期生物濾池出水中總有機(jī)碳的濃度就出現(xiàn)顯著下降，說(shuō)明以有機(jī)碳為碳源的異養(yǎng)菌形成；20 d以后2個(gè)測(cè)試點(diǎn)的無(wú)機(jī)碳才開(kāi)始出現(xiàn)顯著下降，說(shuō)明以無(wú)機(jī)碳為碳源的自養(yǎng)菌形成[29]，因此，推測(cè)本系統(tǒng)中最早出現(xiàn)并穩(wěn)定發(fā)揮功能的是異養(yǎng)菌群落，而自養(yǎng)菌群落的出現(xiàn)則相對(duì)滯后。

3.2 低溫氮降解細(xì)菌富集后的降氮效果

自然條件下具有氮降解功能的細(xì)菌數(shù)量非常有限，而可被人工分離得到的細(xì)菌數(shù)量更是僅占全部細(xì)菌的1%，因此要得到具有某種特定功能的細(xì)菌，需要先進(jìn)行選擇富集，使具有該功能細(xì)菌的數(shù)量增長(zhǎng)到足夠多時(shí)，才有可能將該功能細(xì)菌分離出來(lái)。當(dāng)前，針對(duì)氮降解細(xì)菌的富集，主要通過(guò)提供不同的氮源來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)不同功能氮降解細(xì)菌的富集，其中，有的以氨氮為氮源富集可以降解氨氮的亞硝化細(xì)菌，有以亞硝酸氮為氮源富集可以降解亞硝酸氮的硝化細(xì)菌[30-31]，也有的以添加氨氮為氮源進(jìn)行硝化細(xì)菌的富集[32]。在富集周期上，從7～20天不等，由于硝化細(xì)菌生長(zhǎng)較慢，所以需要富集幾個(gè)周期才可以完成[12-13]。在本研究中，通過(guò)對(duì)比幾個(gè)周期富集菌液的降氮效果，發(fā)現(xiàn)對(duì)降氮細(xì)菌進(jìn)行周期式的富集會(huì)提高富集和降氮效果，但由于生活環(huán)境的限制，富集到一定周期后降氮細(xì)菌數(shù)量會(huì)達(dá)到頂峰，即使增加富集周期也不會(huì)提高富集效果。其中，富集培養(yǎng)基以添加亞硝酸氮為氮源時(shí)，富集到的菌液的降氮效果較好。

3.3 低溫氮降解細(xì)菌的分離和鑒定

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的生物濾料需要形成成熟的生物膜后才能穩(wěn)定發(fā)揮凈水功能。生物濾料掛膜過(guò)程中，可通過(guò)添加微生態(tài)制劑輔助進(jìn)行掛膜[17]，或接種加入功能穩(wěn)定的生物濾料以幫助系統(tǒng)加速建立硝化作用[33]，但實(shí)際生產(chǎn)中還需要避免引入外來(lái)病原微生物，因此最穩(wěn)妥的方法是對(duì)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物濾料上自身附著的土著菌進(jìn)行培養(yǎng)[34]，后期添加至生物濾料上以幫助穩(wěn)定水處理效果。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)前期富集得到的混合菌液進(jìn)行分離、純化后，最終得到4株對(duì)氨氮和亞硝酸氮降解效果好的菌株，這4株細(xì)菌對(duì)氨氮的降解率可達(dá)85%以上，對(duì)亞硝酸氮達(dá)99%以上，可用于后期添加至生物濾料上，既可以降低引入外來(lái)病原微生物的風(fēng)險(xiǎn)，還以幫助提高生物濾料的水處理效率。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究通過(guò)對(duì)新建成的商業(yè)規(guī)模的冷水魚(yú)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的生物濾池的成熟過(guò)程進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)即使在17～18 ℃的低水溫條件下 ，生物濾池經(jīng)過(guò)40 d的培養(yǎng)也可以完成成熟過(guò)程。受較高溶氧條件的限制，成熟后的生物濾池只能將養(yǎng)殖水中高毒害的氨氮和亞硝酸氮轉(zhuǎn)化為低毒害的硝酸氮，而無(wú)法通過(guò)反硝化作用，將氮和磷從系統(tǒng)中移除。同時(shí)，根據(jù)水體中有機(jī)碳和無(wú)機(jī)碳的變化，推測(cè)生物濾料上自養(yǎng)菌群的產(chǎn)生滯后于異養(yǎng)菌群。采集成熟生物濾料上的生物膜進(jìn)行富集培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)在15 ℃，160 r/min的條件下，通過(guò)添加以亞硝酸氮為氮源的富集培養(yǎng)基，以7 d為1個(gè)周期，富集6個(gè)周期可以得到降氮效果最好的富集菌液。對(duì)富集得到的菌液進(jìn)行分離、純化和鑒定后，共得到4株可在低溫條件下有效降解氨氮和亞硝酸氮的細(xì)菌，分別為枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis)、Velezensis芽孢桿菌 (Bacillusvelezensisstrain SQ-5)、土芽孢桿菌 (Geobacillussp. strain SA2)和短小芽孢桿菌 (Bacilluspumilusstrain AB25A-SW1)。