刁 菁， 李 樂， 王曉璐， 許 拉， 于曉清， 蓋春蕾， 樊 英， 葉海斌?? ， 劉洪軍， 王勇強

(1. 山東省海洋生物研究院，山東 青島 266104； 2.山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，山東 青島 266104； 3.日照市萬澤豐漁業(yè)有限公司，山東 日照 250000)

殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)是導(dǎo)致冷水魚癤瘡病及皮膚潰瘍病的病原菌，其宿主范圍廣，包含至少5個亞型，是冷水魚養(yǎng)殖過程中危害較重的一種常見致病菌[1-3]，對于該菌的防治技術(shù)研究一直是國內(nèi)外關(guān)注焦點。目前，魚用疫苗是公認最安全有效的防病途徑，特別是針對大型深海網(wǎng)箱及養(yǎng)殖工船等裝備型養(yǎng)殖模式，如果在入海前對魚體實施疫苗免疫，能夠提高魚體對特定病原的抗病力，從而降低深海養(yǎng)殖過程中的疾病發(fā)生率。在水產(chǎn)疫苗工業(yè)中最為常用的形式是滅活疫苗, 例如弧菌、氣單胞菌和草魚呼腸孤病毒等滅活疫苗的免疫保護性非常明顯[4-6]。滅活是滅活疫苗生產(chǎn)中最關(guān)鍵、最基本的技術(shù)之一, 抗原滅活效果的好壞與滅活劑息息相關(guān), 理想的滅活應(yīng)是滅活病原徹底并保持抗原的免疫原性,免疫疫苗后機體產(chǎn)生良好的免疫保護, 同時無論對魚類還是人類, 均不產(chǎn)生安全問題?；瘜W滅活劑甲醛是最傳統(tǒng)且應(yīng)用最廣泛的滅活劑，但是存在刺激性、致癌危險、破壞免疫原性、滅活不徹底、滅活時間長、滅活效果受多種因素影響等缺陷[7], 因此篩選較甲醛更優(yōu)良的滅活劑已成為當前滅活疫苗研制中需要解決的迫切課題, 對于生產(chǎn)高效、安全的滅活疫苗具有十分重要的意義。

鋅是一種動物必需的微量元素，多項研究表明鋅能夠影響動物的生長、發(fā)育、免疫、成骨以及代謝功能[8-9]。同時，鋅還具有良好的抗菌作用，特別是利用納米技術(shù)研制的納米鋅抗菌劑，它具有表面效應(yīng)、體積效應(yīng)及量子尺寸效應(yīng)等一系列納米材料特有性質(zhì)，能大大提升傳統(tǒng)鋅材料的抗菌性能，對于革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及真菌和病毒等均顯示出顯著的殺滅作用[10-11]，并且納米鋅作為一種新型鋅源，具有良好的生物相容性，同時還具有較高的生物活性、良好的免疫調(diào)節(jié)能力和高吸收率。由于其性狀穩(wěn)定、資源豐富且對環(huán)境無毒害作用，目前已推廣應(yīng)用于醫(yī)藥、畜牧、公共衛(wèi)生等多個領(lǐng)域。

鑒于以上納米鋅優(yōu)良的特性，為了探究納米鋅用于制備水產(chǎn)動物細菌滅活疫苗的可行性，本研究測定了納米鋅溶液在不同條件下對殺鮭氣單胞菌的滅活作用，檢測了納米鋅滅活對殺鮭氣單胞菌菌體蛋白和免疫原性影響，制備出殺鮭氣單胞菌納米鋅滅活疫苗并與甲醛滅活疫苗的免疫保護效果進行了比較，另外研究了納米鋅溶液對魚類細胞生長及增殖的影響。研究結(jié)果為魚用滅活疫苗的研制及應(yīng)用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

殺鮭氣單胞菌為本實驗室分離保藏的菌株；鯉上皮瘤 (Epithelioma papulosum cyprini，EPC) 細胞由山東省出入境檢驗檢疫局惠贈；健康硬頭鱒(Oncorhynchusmykiss)由日照萬澤豐漁業(yè)有限公司提供，平均體重為(105±5) g，平均體長為(20±2) cm。

納米鋅水溶液原液(濃度為50 g/L)由南京精德豐新材料科技有限公司研制，其中納米鋅粒徑為30～80 nm；M199培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶為Gibco公司產(chǎn)品；阿爾瑪藍購自美國Invitrogen公司；96孔細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司；Mueller-Hinton(MH)肉湯和瓊脂購自青島海博生物有限公司；上樣緩沖液購自索萊寶公司；AP標記羊抗鼠Ig購自Sigma公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳及其他化學試劑均購自上海生物工程有限公司。

1.2 不同條件下納米鋅對殺鮭氣單胞菌的滅活效果

待滅活細菌的準備：將MH肉湯中過夜培養(yǎng)的殺鮭氣單胞菌室溫6 000 r/min離心10 min，細菌沉淀用生理鹽水(0.9% NaCl溶液)重懸，再離心收集沉淀，重復(fù)2次，最后用生理鹽水重懸并調(diào)整細菌濃度至1.5×109個/mL，分裝于50 mL離心管內(nèi)，每管30 mL。

納米鋅滅活實驗：共設(shè)置4個納米鋅滅活濃度，即用生理鹽水將納米鋅原液進行稀釋并分別加入上述離心管內(nèi)充分混勻，最終管內(nèi)納米鋅終濃度分別為50、100、200和400 mg/L，對照管加入等體積生理鹽水。然后將每個滅活管內(nèi)菌液分為3等份，分別放置于4、28及37 ℃條件下進行滅活。每隔12h，從各滅活管內(nèi)取1mL菌液，離心收集沉淀并用生理鹽水洗滌2次去除納米鋅，然后取重懸后的菌液涂布MH瓊脂培養(yǎng)板，每個處理涂布3個平板，每板涂布100 μL。將平板置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)48 h后觀察并記錄細菌生長情況。剩余菌液用于菌體蛋白及免疫原性的檢測。

1.3 納米鋅對殺鮭氣單胞菌菌體蛋白及免疫原性的影響

1.3.1 SDS-PAGE檢測納米鋅對殺鮭氣單胞菌菌體蛋白組成的影響 根據(jù)1.2實驗結(jié)果，在收集的不同濃度及不同溫度條件下，最短滅活時間的納米鋅滅活菌液及未滅活的對照菌液中，按體積比1∶4加入4×上樣緩沖液，沸水中煮沸10 min，冷卻后點樣進行SDS-PAGE；電泳凝膠由濃度為12%分離膠和濃度為5%濃縮膠兩部分組成；采用Tris-Gly電泳緩沖液(0.025 mol/L Tris，0.25 mol/L Gly，0.1% SDS，pH=8.3)，4 ℃穩(wěn)流條件下電泳，濃縮膠30 mA，分離膠60 mA，至溴酚藍指示劑遷移至分離膠底部邊緣時停止電泳；將凝膠放入固定液中固定1h，然后用考馬斯亮藍(CBB-R250)染色4h，放入7%乙酸脫色液中脫色，拍照。

1.3.2 掃描電鏡檢測納米鋅對殺鮭氣單胞菌菌體結(jié)構(gòu)的影響 在6 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，分別收集50和400 mg/L濃度納米鋅在不同溫度下滅活的菌體，用2.5%戊二醛前固定, 1%鋨酸后固定, 磷酸緩沖液沖洗, 梯度乙醇脫水, 臨界點干燥后噴金, 經(jīng)AMRAY-1830 型掃描電鏡進行觀察。

1.3.3 間接ELISA檢測納米鋅對殺鮭氣單胞菌免疫原性的影響 離心收集培養(yǎng)至指數(shù)生長期的殺鮭氣單胞菌，將菌體密度調(diào)整至5×107CFU/mL，參考張銘偉等[12]方法以全菌免疫小鼠制備鼠抗殺鮭氣單胞菌多克隆血清抗體。同時，在4 ℃條件下離心收集4種濃度納米鋅在不同溫度下最短時間滅活的菌體及未滅活的對照菌體，并用生理鹽水調(diào)整濃度至OD600為0.1±0.01，然后加入酶標板中4 ℃包被過夜；次日加入3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液，37 ℃下封閉45 min；去除封閉液，用PBST洗3次，每次5 min；加入鼠抗殺鮭氣單胞菌血清(1∶200)，37 ℃ 孵育1 h(間或輕輕震蕩)，陰性對照為免疫前小鼠血清； PBST洗3次后，加入AP標記羊抗鼠Ig，37 ℃下孵育1 h；PBST洗3次后，將pNPP發(fā)色液加入酶標板發(fā)色30 min，2 mol/L NaOH終止發(fā)色，酶標儀405 nm測OD值。

1.4 殺鮭氣單胞菌納米鋅滅活疫苗的免疫保護力測定

根據(jù)1.3結(jié)果，選擇對殺鮭氣單胞菌菌體蛋白及免疫原性影響最小的納米鋅滅活參數(shù)，制備出納米鋅滅活疫苗；同時利用0.1%的甲醛溶液在28 ℃條件下對殺鮭氣單胞菌滅活5 h，經(jīng)平板涂布培養(yǎng)法驗證已徹底滅活，制備出甲醛滅活疫苗；然后將2種滅活疫苗濃度調(diào)整至OD600為0.1±0.01，利用腹腔注射的方法分別免疫健康虹鱒，每尾100 μL，對照組注射同體積的無菌生理鹽水，每組免疫30尾，每組設(shè)3個重復(fù)，養(yǎng)殖水溫為(17±1) ℃，全天充氣，每天換水50%；免疫后40 d用殺鮭氣單胞菌進行攻毒，每尾腹腔注射濃度為5.0×107CFU/mL的菌液100 μL；每天定時觀察并記錄各實驗組魚體死亡數(shù)量，計算2種滅活疫苗對殺鮭氣單胞菌感染的相對免疫保護率。

1.5 納米鋅對鯉上皮瘤(EPC)細胞毒性的研究

將納米鋅溶液用M199培養(yǎng)基(含2%胎牛血清)2倍梯度稀釋至濃度為100、200、400、800、1 600和3 200 mg/L，然后分別與密度為2.5×106個/mL的EPC細胞懸液1∶1混合均勻，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL，每個處理設(shè)3個重復(fù)，置于20 ℃培養(yǎng)，12 h后觀察細胞貼壁情況，3 d后觀察細胞存活情況,6 d后在每個孔內(nèi)加入10 μL阿爾瑪藍指示劑，置于20 ℃培養(yǎng)4 h，用酶標儀在570 nm測定波長下和605 nm參考波長下測定OD值，計算細胞活性值。

2 結(jié)果

2.1 不同溫度條件下納米鋅對殺鮭氣單胞菌的滅活效果

在3個不同溫度條件下分別加入不同濃度的納米鋅，經(jīng)過不同時間孵育處理殺鮭氣單胞菌后，菌體存活情況經(jīng)測定顯示，加入的納米鋅濃度越高，其對殺鮭氣單胞菌完全滅活的時間越短，同時隨著作用溫度的升高，納米鋅對菌體完全滅活的時間縮短(見表1)。400、200、100 和50 mg/L濃度的納米鋅分別在72、96、108和120 h之內(nèi)可以將殺鮭氣單胞菌完全滅活；同樣濃度納米鋅在不同溫度下對細菌的滅活時間不同，其中在37 ℃條件下納米鋅滅活時間最短，4種濃度納米鋅均可在60 h內(nèi)將細菌完全滅活，400 mg/L納米鋅在24 h內(nèi)即可將細菌完全滅活；其次為28 ℃條件下，4種濃度納米鋅均可在96 h內(nèi)將細菌完全滅活；滅活作用最慢的為4 ℃條件下，完全滅活時間最短為72 h，最長達到120 h。

表1 不同濃度納米鋅在不同溫度下孵育處理殺鮭氣單胞菌不同時間后菌體的存活情況

注：+表示細菌存活，-表示細菌死亡。Note: + means alive bacteria, - means inactivated bacteria.

2.2 納米鋅對殺鮭氣單胞菌菌體蛋白及免疫原性的影響

2.2.1 SDS-PAGE檢測納米鋅對菌體蛋白的影響 將收集的不同濃度及不同溫度條件下，最短滅活時間的納米鋅滅活菌體收集進行SDS-PAGE，凝膠經(jīng)考馬斯亮藍染色后觀察滅活菌體蛋白組成及濃度變化，如圖1所示，不同條件下納米鋅滅活的殺鮭氣單胞菌菌體蛋白組成及濃度與未經(jīng)納米鋅滅活的殺鮭氣單胞菌相同，沒有出現(xiàn)蛋白條帶丟失或蛋白濃度明顯降低的現(xiàn)象。

2.2.2 掃描電鏡觀察納米鋅對菌體形態(tài)的影響 利用掃描電鏡分別觀察了50和400 mg/L濃度納米鋅在不同溫度下滅活的菌體形態(tài)，如圖2所示，在4和28 ℃滅活條件下，2種濃度納米鋅對菌體完整性的破壞程度相差不大，滅活后的菌體大部分保持了原有的完整結(jié)構(gòu)，僅出現(xiàn)少量細菌碎片，但37 ℃滅活條件下，滅活后的菌體結(jié)構(gòu)破壞較明顯，視野中出現(xiàn)較多的菌體碎片。

(M. 蛋白Marker；1.正常細菌對照; 2. 400 mg/L-4 ℃-72 h滅活菌體; 3. 400 mg/L-28 ℃-60 h滅活菌體; 4. 400 mg/L-37 ℃-24 h滅活菌體; 5. 200 mg/L-4 ℃-96 h滅活菌體; 6. 200 mg/L-28 ℃-72 h滅活菌體; 7. 200 mg/L-37 ℃-36 h滅活菌體; 8. 100 mg/L-4 ℃-108 h滅活菌體; 9. 100 mg/L-28 ℃-84 h滅活菌體; 10. 100 mg/L-37 ℃-60 h滅活菌體; 11. 50 mg/L-4 ℃-120 h滅活菌體; 12. 50 mg/L-28 ℃-96 h滅活菌體; 13 50 mg/L-37 ℃-60 h滅活菌體。M. Marker; 1. normal bacteria as control; 2. 400 mg/L-4 ℃-72 h inactivated bacteria; 3. 400 mg/L-28 ℃-60 h inactivated bacteria; 4. 400 mg/L-37 ℃-24 h inactivated bacteria; 5. 200 mg/L-4 ℃-96 h inactivated bacteria; 6 200 mg/L-28 ℃-72 h inactivated bacteria; 7. 200 mg/L-37 ℃-36 h inactivated bacteria; 8 100 mg/L-4 ℃-108 h inactivated bacteria; 9. 100 mg/L-28 ℃-84 h inactivated bacteria; 10. 100 mg/L-37 ℃-60 h inactivated bacteria; 11. 50 mg/L-4 ℃-120 h inactivated bacteria; 12. 50 mg/L-28 ℃-96 h inactivated bacteria; 13. 50 mg/L-37 ℃-60 h inactivated bacteria.)

圖1 不同濃度納米鋅在不同溫度條件下最短時間滅活菌體的SDS-PAGE結(jié)果

Fig.1 The SDS-PAGE of inactivated bacteria with shortest time under different concentrations of nanometer zinc and temperature

(A1. 50 mg/L-4 ℃-120 h滅活菌體; A2. 50 mg/L-28 ℃-96 h滅活菌體; A3. 50 mg/L-37 ℃-60 h滅活菌體; B1. 400 mg/L-4 ℃-72 h滅活菌體; B2. 400 mg/L-28 ℃-60 h滅活菌體; B3. 400 mg/L-37 ℃-24 h滅活菌體。A1. 50 mg/L-4 ℃-120 h inactivated bacteria; A2. 50 mg/L-28 ℃-96 h inactivated bacteria; A3. 50 mg/L-37 ℃-60 h inactivated bacteria; B1 400 mg/L-4 ℃-72 h inactivated bacteria; B2 400 mg/L-28 ℃-60 h inactivated bacteria; B3 400 mg/L-37 ℃-24 h inactivated bacteria.)

圖2 掃描電鏡檢測不同濃度納米鋅在不同溫度條件下滅活菌體的形態(tài)

Fig.2 Scanning electron microscopic image of inactivated bacteria under different concentrations of nanometer zinc and temperature

2.2.3 ELISA檢測納米鋅對菌體抗原性的影響 利用制備的抗血清結(jié)合ELISA技術(shù)檢測不同滅活條件下殺鮭氣單胞菌抗原性結(jié)果顯示，與包被未滅活菌體的對照組相比，4 ℃條件下各納米鋅濃度滅活組菌體抗原性均未受到顯著性影響，然而在28 ℃條件下，200和400 mg/L納米鋅滅活組菌體抗原性顯著低于對照組，而在37 ℃條件下除50 mg/L濃度組外，其它3個濃度滅活組抗原性均顯著低于對照組。在4和28 ℃條件下，不同濃度納米鋅滅活菌體的抗原性沒有顯著性差異，而在37 ℃條件下,不同濃度納米鋅滅活菌體的抗原性受到不同程度的影響，其中400 mg/L納米鋅滅活組菌體抗原性顯著低于50 mg/L滅活組(見圖3)。

圖3 不同滅活條件對殺鮭氣單胞菌菌體抗原性的影響

2.3 殺鮭氣單胞菌納米鋅滅活疫苗的免疫保護力

根據(jù)以上結(jié)果，從滅活效率及疫苗抗原性保持的效果出發(fā)，選擇100 mg/L-28 ℃為殺鮭氣單胞菌納米鋅滅活疫苗制備條件。為了比較納米鋅與甲醛滅活全菌疫苗的免疫保護效果，在免疫后40 d以殺鮭氣單胞菌活菌進行攻毒。攻毒后，注射生理鹽水組的魚體在攻毒后第2天便開始出現(xiàn)死亡，并且魚體在接下來的一周內(nèi)出現(xiàn)大量死亡，直至攻毒后第10天死亡率達到96.7%。2個免疫組魚體的死亡率顯著低于對照組，在攻毒后第10天納米鋅與甲醛滅活菌體免疫組魚體的死亡率分別為13.3%與20%，計算其免疫保護率分別為86.2%與79.3%，2個免疫組均表現(xiàn)出較好的免疫保護效果(見圖4)。攻毒受感的魚體表現(xiàn)出腹鰭基部充血發(fā)紅、肛門突出、肌肉出血、腸道出血等殺鮭氣單胞菌感染的典型臨床癥狀，并能從受感死亡魚體中再次分離到該菌株。

圖4 納米鋅與甲醛滅活的殺鮭氣單胞菌菌苗的免疫保護效果

2.4 納米鋅對鯉上皮瘤(EPC)的細胞毒性

將懸浮的EPC細胞與不同濃度的納米鋅溶液混合后接種于細胞培養(yǎng)板中，觀察細胞貼壁及生長情況，如表2所示，高濃度1 600 mg/L納米鋅溶液會影響細胞的正常貼壁，低于800 mg/L濃度的納米鋅溶液不會影響細胞正常貼壁(見圖5)，但是800 mg/L濃度納米鋅處理后的細胞逐漸收縮脫壁趨于死亡(見圖5)；利用阿爾瑪藍指示劑測定6 d后EPC細胞活性，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，濃度低于400 mg/L納米鋅溶液對細胞生長及代謝無顯著影響，濃度高于800 mg/L納米鋅溶液會影響細胞正常增殖代謝。

表2 不同濃度納米鋅對EPC細胞貼壁及生長的影響

Note：①Concentration of anometer zinc；②Cell adherence after 12 h；③Cell growth after 3 d；④Cell viability after 6 d

(A. 400 mg/L納米鋅孵育后細胞正常貼壁；B. 1 600 mg/L納米鋅孵育后細胞無法貼壁；C. 400 mg/L納米鋅孵育后3天細胞正常生長；D. 1 600 mg/L納米鋅孵育后3天細胞死亡。標尺=20 μm。A. normal adherence of cells post incubation with 400 mg/L Nano-Zn; B. un-adherent cells post incubation with 1 600 mg/L Nano-Zn; C. Normal growth of cells on day 3 post incubation with 400 mg/L Nano-Zn; D. all cells died on day 3 post incubation with 1 600 mg/L Nano-Zn. Bar=20 μm.)

圖5 不同濃度納米鋅作用下的EPC細胞形態(tài)

Fig.5 The EPC cell morphology under different concentrations of nanometer zinc

3 討論

納米鋅是一種新型高功能精細無機材料，粒徑在1～100 nm之間，因其特有的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)，使得納米鋅具有無法比擬的特殊性能和用途，其在中性環(huán)境中無需光照即可表現(xiàn)出顯著的抗菌活性，目前該材料已逐漸被應(yīng)用于醫(yī)療、保健、衛(wèi)生等多個領(lǐng)域，已成為無機抗菌劑研究的熱點[13]。本文首次將納米鋅材料作為水產(chǎn)動物病原菌的滅活劑進行嘗試使用，實驗結(jié)果顯示納米鋅對殺鮭氣單胞菌具有明顯的殺滅效果，其殺菌活性的強弱與納米鋅的濃度密切相關(guān)。前期研究結(jié)果同樣顯示，在納米鋅粒徑相同的情況下，其抗菌活性會隨著濃度的增加而增強[14]。前期研究還表明相同濃度納米鋅對不同種類的細菌具有不同的抑殺效果，Xie等[15]比較研究了納米鋅對4種食物源性病原菌的抑殺效果，結(jié)果顯示納米鋅在0.5 mg/mL的濃度下即可在3 h內(nèi)滅活108CFU/mL的空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)，相比而言大腸桿菌O157∶H7對納米鋅的殺菌活性具有更強的耐受性。高艷玲等[16]也研究證實，納米鋅對枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的抑制能力最強，其次是傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，然而對李氏桿菌(Listeriamonocytogenes)沒有明顯抑制作用。本研究結(jié)果顯示不同濃度的納米鋅在不同溫度條件下均能有效滅活殺鮭氣單胞菌，只是在滅活時長上存在一定差異。分析造成納米鋅對不同細菌滅活效果差異的原因，一方面是由于菌種本身的遺傳特性差異決定其對納米鋅的耐受度不同，也有可能會由于不同學者使用的納米鋅顆粒的粒徑差異影響其抗菌活性。前期已有研究發(fā)現(xiàn)納米鋅抗菌效果與粒徑大小相關(guān)，一般認為是粒徑越小的納米鋅抗菌活性越強[17-19]。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高納米鋅對殺鮭氣單胞菌的滅活能力有著顯著的提升，然而目前有關(guān)溫度影響納米鋅抗菌活性的機理未有研究報道，我們推測升高溫度可促進納米鋅與細菌生物大分子的互作，進而增強其對細胞生物活性分子的破壞[20]。

利用理化方法滅活制備全菌疫苗都會不同程度地對菌體抗原性造成破壞，進而降低疫苗的免疫原性與免疫保護效果[21]，因而如何最大限度地保留菌體抗原性是一切滅活策略應(yīng)該首要考慮的技術(shù)問題。本研究結(jié)果顯示，各濃度納米鋅在不同溫度條件下滅活處理并未造成菌體蛋白的明顯缺失與變化，說明利用納米鋅殺滅菌體是一種相對溫和的滅活方法。然而，掃描電鏡與ELISA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)當高濃度納米鋅在高溫條件下處理菌體，可不同程度地對引起菌體破損，且免疫原性也會在一定程度上受到影響。高濃度納米對菌體抗原性的影響可能與其抗菌機理密切相關(guān)，已有研究證實，納米鋅的抗菌機理主要存在4種可能的方式：(1)通過釋放的離子與帶電的細菌細胞壁之間的靜電相互作用；(2)鋅離子的釋放或活性氧(ROS)的形成造成細菌細胞膜的破壞；(3)鋅離子或者ROS的形成破壞細菌細胞的DNA和蛋白質(zhì)合成；(4)由于膜的破壞，細胞內(nèi)容物泄漏可導(dǎo)致細胞膜收縮，細胞裂解[22]。因而，在利用納米鋅制備全菌滅活疫苗時，還應(yīng)該基于菌體破壞情況及抗原影響情況選擇最為溫和、高效的滅活策略。

納米鋅由于其具有良好的生物相容性，對人體、養(yǎng)殖動物及環(huán)境無毒害作用，加之其具有抗紅外、紫外和殺菌的功能，在很多領(lǐng)域尤其是在與人類生存和健康密切相關(guān)的方面有著獨特的優(yōu)勢，將會給人類的醫(yī)療和健康帶來巨大的貢獻[20]。目前評價納米材料生物毒性的方法包括體內(nèi)和體外2種，其中體外評價是一種重要的毒性檢測手段，一般以組織或細胞為試驗對象，這種檢測方法快速、簡便、組間差異小[23-24]。本研究主要從體外細胞貼壁、形態(tài)以及細胞活性三個方面，評價了納米鋅對魚類細胞的毒性。結(jié)果顯示，濃度低于400 mg/L的納米鋅溶液對魚類EPC細胞的生長及代謝無顯著影響，而該濃度水平的納米鋅對殺鮭氣單胞菌卻能表現(xiàn)出較強滅活效果，說明納米鋅對生物細胞具有一定的選擇毒性。石慧等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在半滑舌鰨飼料中添加適量的納米鋅可不同程度地提升魚體胰臟及腸道消化酶的活性，而未對魚體健康狀態(tài)產(chǎn)生明顯的毒副作用。另有研究顯示，在半滑舌鰨基礎(chǔ)飼料中添加納米鋅時，既可以提高半滑舌鰨的生長性能，又可以提高其非特異性免疫力，同時對其肝臟影響較小[26]。因此，利用低濃度的納米鋅作為滅活劑應(yīng)用于魚類全菌滅活疫苗的制備不會存在安全性問題。

當前世界范圍內(nèi)，全菌滅活疫苗仍是開展細菌性疫病免疫防控的主流免疫制劑，因此篩選一種安全有效的滅活制劑建立科學高效的滅活策略對于促進全菌滅活疫苗的研制與應(yīng)用具有重要價值。甲醛是目前應(yīng)用最廣泛的化學滅活劑，但是由于其在安全性及滅活效果方面存在一定的不足[7], 因此篩選較甲醛更優(yōu)良的滅活劑具有重要的實際意義。本研究結(jié)果顯示，納米鋅對殺鮭氣單胞菌具有良好的滅活效果，且免疫保護實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)納米鋅滅活全菌疫苗顯示出較甲醛滅活全菌疫苗更好的免疫保護效果，說明納米鋅滅活對菌體抗原性的破壞較甲醛更為溫和，且用于滅活的納米鋅濃度遠遠低于其毒性濃度，從疫苗制備工藝及安全性上也優(yōu)于甲醛。

4 結(jié)語

本文研究了納米鋅對殺鮭氣單胞菌的滅活作用及其細胞毒性，發(fā)現(xiàn)納米鋅是一種安全、優(yōu)良的疫苗滅活劑，具有潛在應(yīng)用價值。研究結(jié)果為高效、安全漁用滅活疫苗的研制提供了數(shù)據(jù)和參考。