■ 梁潔雯 范怡杰 莫文艷 陳 冰 吳浩敏 周艷玲 張 超 王國霞 *

（1.佛山市順德區(qū)金閃閃飼料有限公司，廣東佛山528000；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，廣東廣州510640；3.農(nóng)業(yè)部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東廣州510642；4.廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣東廣州510642）

中華草龜（Chinemys reevesii）作為中國分部最廣、種類最多的龜鱉目龜科烏龜屬，又叫泥烏、草龜?shù)萚1]。中華草龜肉高蛋白、低脂肪，氨基酸組成相對較平衡，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源；同時中華草龜還含有豐富的不飽和脂肪酸（EPA、DHA等）和礦物質(zhì)以及微量元素（鈣、鐵、鋅、硒等）[2]。此外，中華草龜還可作為一種觀賞性寵物，其龜甲可以入藥[3]，具有較高的營養(yǎng)保健作用和經(jīng)濟價值[4]。隨著人們生活水平的提高，龜類作為一種在民間得到充分認可的傳統(tǒng)滋補保健食品，有著廣闊的利用前景[5]。中華草龜養(yǎng)殖量呈現(xiàn)逐年增長趨勢，質(zhì)優(yōu)價廉的飼料開發(fā)也成為配方師的關(guān)注點。

蛋白質(zhì)是動物生長發(fā)育的基礎(chǔ)，與畜禽不同，龜是以蛋白飼料為主，一般其飼料蛋白含量是畜禽的2～4倍。有研究發(fā)現(xiàn)，龜飼料中蛋白含量達到50%[6-7]。目前，魚粉及動物性蛋白源作為烏龜飼料中蛋白的主要來源，由于其價格昂貴以及資源緊缺，使得飼料成本占養(yǎng)殖成本的比例較高[8]，所以提高烏龜對飼料中蛋白質(zhì)的消化利用率是降低養(yǎng)殖成本的有效途徑。水產(chǎn)動物其消化特點與畜禽有很大不同，體溫隨水溫或氣候而變化，從而導(dǎo)致體內(nèi)消化酶活性也隨之發(fā)生改變[9-10]。同時由于水產(chǎn)動物消化系統(tǒng)不如畜禽完善，內(nèi)源性消化酶也不如畜禽發(fā)達，限制了其對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的消化。因此，添加外源性酶制劑，特別是蛋白酶是一種簡單易行的提高水產(chǎn)動物對蛋白質(zhì)利用率的手段。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加蛋白酶可顯著提高鯉魚的生長及消化酶活性[11]。顯著提高青魚消化能力[12]，但是蛋白酶在中華草龜飼料中的應(yīng)用還未見報道。

目前，關(guān)于中華草龜?shù)娜斯ゐB(yǎng)殖技術(shù)[13-14]、藥用價值[15]、配合飼料與營養(yǎng)需要量[16-17]、胚胎生長發(fā)育[18-21]方面的報道較多。而如何提高中華草龜對蛋白質(zhì)的消化吸收、降低養(yǎng)殖成本是我們關(guān)注的重點。本試驗研究不同劑量蛋白酶對中華草龜生長性能、形體指標(biāo)及消化道消化酶的影響，為蛋白酶在中華草龜飼料中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

試驗飼料由佛山市順德區(qū)金閃閃飼料有限公司提供，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗分為3個處理，分別記為G0組（對照組）、G15組和G20組。處理G15組和G20組是在基礎(chǔ)日糧中分別添加了150 mg/kg和200 mg/kg的蛋白酶。

1.2 試驗動物及飼養(yǎng)管理

試驗動物中華草龜苗由順德煒杰龜種場提供。

養(yǎng)殖試驗在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所水產(chǎn)試驗場的水泥池（池長80 cm、寬120 cm、高70 cm）中進行，每個池子底部放入大小接近的3塊石棉瓦，養(yǎng)殖期間水位高度為5～10 cm。將購買的中華草龜苗暫養(yǎng)于室外水泥池中，每天飽食投喂2次，馴養(yǎng)1周后進行試驗分組。挑選健康、活潑、體質(zhì)量約為5.74 g的中華草龜苗810只，隨機分為3組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)90只，分別投喂3種試驗飼料。養(yǎng)殖水源為自來水。飼養(yǎng)期間，每天投喂2次（8:00～9:00，16:00～17:00），投飼率為 4%～6%，pH 值7.8±0.4，水溫（28±4）℃。每周檢測水質(zhì)并換水，養(yǎng)殖周期為56 d。

1.3 樣品采集

飼養(yǎng)試驗結(jié)束時，禁食 24 h，稱重，計算增重率、特定生長率和飼料系數(shù)。每個重復(fù)取25只龜，用游標(biāo)卡尺測量背甲長、背甲寬、腹甲長、腹甲寬、殼高5項體型性狀指標(biāo)。每個重復(fù)隨機挑選6只龜解剖并取出肝臟、胃和全腸，稱重，用4℃的生理鹽水清洗后用凍存管分裝，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。計算肝體比、胃體比和腸體比。

1.4 測定指標(biāo)與方法

肝臟、胃和全腸的脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶活性均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定，具體測定方法參照試劑盒說明書進行。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)，%）

1.5 計算公式

增重率（%）=（末均重-初均重）/初均重×100

特定生長率（%/d）=[Ln（末均重）-Ln（初均重）]/飼養(yǎng)天數(shù)×100

飼料系數(shù)=攝食量/（終末總重-初始總重）

肝體比(%)=(肝胰腺質(zhì)量/體質(zhì)量)×100

胃體比(%)=(胃質(zhì)量/體質(zhì)量)×100

腸體比(%)=(腸質(zhì)量/體質(zhì)量)×100

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用SPSS 18軟件進行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計，先對數(shù)據(jù)作單因素方差分析（One-way ANOVA），若組間差異顯著，再采用Duncan's法進行多重比較，P＜0.05，表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 各組飼料對中華草龜生長性能的影響(見表2)

表2 各組飼料對中華草龜生長性能的影響(n=3)

從表2可知，各組中華草龜?shù)拇婊盥史謩e為97.41%、97.04%和98.15%，試驗組中華草龜?shù)捏w末均重、增重率、特定生長率均高于對照組。與對照組相比，試驗組G15和G20的增重率分別提高了11.55%和2.88%，飼料系數(shù)降低了10.06%和3.14%，但差異均不顯著（P＞0.05）。

2.2 各組飼料對中華草龜形體指標(biāo)的影響(見表3)

由表3可知，與對照組相比，試驗組中華草龜?shù)谋臣组L、背甲寬、腹甲寬、殼高和胃體比增加，其中G15組龜?shù)谋臣讓掞@著大于G0組和G20組（P＜0.05），G20組腹甲長顯著大于G0組和G15組（P＜0.05）。G20組龜?shù)臍じ唢@著大于G0組（P＜0.05）。G15組肝體比顯著低于G0組和G20組（P＜0.05）。

2.3 各組飼料對中華草龜消化酶活性的影響(見表4)

由表4數(shù)據(jù)可知，中華草龜腸道中脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶的活力明顯高于胃和肝臟中各酶的活性。與對照組相比，試驗組中華草龜?shù)奈浮⒏闻K和腸道（除G15組的脂肪酶和G20組的胰蛋白酶外）中三種酶活性均高于對照組，且試驗G15組和G20組的肝臟胰蛋白酶活性顯著高于對照組（P＜0.05），G15組腸道胰蛋白酶活性顯著高于G0組和G20組（P＜0.05），G20組胰蛋白酶活性顯著低于G0組（P＜0.05）。

表3 各組飼料對中華草龜形體指標(biāo)的影響

表4 各組飼料對中華草龜消化道消化酶活性的影響

3 討論

3.1 蛋白酶對中華草龜生長性能的影響

蛋白酶已廣泛用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中，它不僅能夠顯著提高飼料中蛋白消化率和飼料利用效率[22]，還可提高動物對魚粉的利用效率[23]，而且對其它替代性蛋白具有同樣的促進作用[24]。譚崇桂等[25]研究表明在魚粉含量為23%的凡納濱對蝦幼蝦飼料中添加175 mg/kg蛋白酶，提高凡納濱對蝦增重率11.25%，降低飼料系數(shù)0.09%。宋紅利等[26]研究表明，在魚粉含量為10%的凡納濱對蝦飼料中添加175 mg/kg的蛋白酶能夠顯著提高凡納濱對蝦的增重率及飼料利用率。這說明蛋白酶的作用效果受飼料配方及養(yǎng)殖條件等的影響。本試驗在魚粉含量為20%的中華草龜飼料中分別添加150 mg/kg和200 mg/kg蛋白酶，中華草龜?shù)脑鲋芈瘦^對照組分別提高了11.55%和2.88%，飼料系數(shù)降低了10.06%和3.14%，增重趨勢與上述研究結(jié)果基本一致，而值得深思的是高劑量的蛋白酶反而不利于中華草龜?shù)脑鲋芈始帮暳舷禂?shù)，說明只有補充適宜劑量的外源蛋白酶才能促進蛋白質(zhì)降解進而提高蛋白質(zhì)利用效率達到提高增重率、降低飼料系數(shù)的效果，過高的外源蛋白酶可能會抑制內(nèi)源蛋白酶的分泌而影響對飼料的消化吸收進而影響生長。目前魚類營養(yǎng)學(xué)常用特定生長率及飼料系數(shù)等指標(biāo)反映魚類生長速率及對營養(yǎng)物質(zhì)利用效率[27]。本試驗結(jié)果顯示，與對照組相比，G15組草龜特定生長率比對照組提高6.77%。不同物種飼料中蛋白酶的最適添加劑量存在差異，中華草龜飼料蛋白酶的最適添加劑量需要進一步研究。

3.2 蛋白酶對中華草龜形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響

費春平等[28]研究發(fā)現(xiàn)，背甲長、背甲寬、腹甲長、腹甲寬和殼高等形態(tài)學(xué)指標(biāo)與龜體重存在線性關(guān)系，特別是背甲長、背甲寬和腹甲長是影響龜體重的主要性狀。賀剛等[29]通過形態(tài)比例性狀測量認為，影響野生黑頸烏龜（Chinemys nigricans）體重大小因素依次為背甲長＞腹甲長＞背甲寬＞體高＞腹甲寬。馬曉等[30]研究表明，中華鱉（Trionyx sinensis）在100日齡和300日齡對體重的直接影響最大的形態(tài)性狀是腹甲長和體高。也有研究表明背甲長和殼高是影響中華草龜、中華花龜及其雜種龜早期體重的共同重要性狀，而不同重要性狀分別是腹甲長、甲橋長及背甲寬等[1]。而本研究發(fā)現(xiàn)，添加150 mg/kg蛋白酶可顯著提高中華草龜?shù)谋臣讓挘?00 mg/kg蛋白酶顯著提高腹甲長和殼高，G15組和G20組中華草龜?shù)脑鲋芈瘦^對照組分別提高了11.55%和2.88%，說明添加外源蛋白酶能夠影響中華草龜?shù)男螒B(tài)學(xué)指標(biāo)，提高其體重，且影響中華草龜早期體重的主要性狀是背甲寬。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的可能原因是不同品種的龜類影響其體重的主要性狀有所不同，或是在中華草龜?shù)牟煌L階段影響其體重的主要性狀會有所改變，而具體的變化過程有待進一步研究。

魚類的內(nèi)臟，特別是肝臟脂肪主要來自對飼料中脂肪的直接吸收以及飼料中過量營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，當(dāng)這些脂肪運至內(nèi)臟后，若不能及時被分解，則會堆積于內(nèi)臟中形成像脂肪肝等肝臟腫大[31]，這不僅造成飼料營養(yǎng)物質(zhì)的浪費，而且還會引起肝臟代謝紊亂[32]。研究發(fā)現(xiàn)，投喂含發(fā)酵豆粕的飼料能夠顯著降低加州鱸的臟體比[33]，低分子殼聚糖也可降低羅非魚的肝體比[34]，說明飼料或某些營養(yǎng)素可以降低脂肪在肝臟中的沉積進而減少脂肪肝發(fā)生率。本研究發(fā)現(xiàn)，G15組可顯著降低中華草龜?shù)母误w比，這表明蛋白酶的添加在一定程度上提高飼料的利用效率，降低了脂肪在肝臟內(nèi)的沉積，促進機體的能量代謝。

3.3 蛋白酶對中華草龜機體消化酶活力的影響

消化酶是由消化系統(tǒng)和消化腺分泌的，起營養(yǎng)和消化作用的酶類[35]。在消化酶中，依消化對象的不同而大致可劃分為蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶等幾種，目前國內(nèi)外對水產(chǎn)動物消化酶研究的報道以中性蛋白酶為最多[36-37]。飼料營養(yǎng)成分、飼料添加劑、環(huán)境因素和外源性酶制劑等都是影響消化酶分泌的因素。聶國興等[38]的研究表明，外源性木聚糖酶抑制羅非魚肝胰臟蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力。龜類消化道與哺乳類動物類似，食物主要在胃腸道中被消化和吸收[39]。Einars?son等[40]研究表明，外源酶制劑的添加可以增加食糜中消化分解產(chǎn)物的含量，刺激腸道化學(xué)感受器誘導(dǎo)促胰酶素的分泌，進而促進消化酶的分泌。目前添加外源性酶制劑對中華草龜機體消化酶的研究還未見報道。飼料作為動物機體消化酶的底物，直接影響胃腸道和肝臟等器官消化酶的活性和分泌，從而調(diào)節(jié)動物體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[41]。宋紅利等[26]研究表明，飼料中添加蛋白酶對凡納濱對蝦肝胰臟中胰蛋白酶活性有顯著提高。譚崇桂等[25]研究發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)飼料中添加175 mg/kg蛋白酶后，可提高凡納濱對蝦肝胰臟中蛋白酶、腸蛋白酶及肝胰臟脂肪酶的活性。本研究結(jié)果表明，飼料中添加150 mg/kg的蛋白酶能夠顯著提高中華草龜肝臟和腸道胰蛋白酶的活性，與上述研究結(jié)果一致。而飼料中添加200 mg/kg的蛋白酶雖然可以顯著提高肝臟胰蛋白酶活性，但卻顯著降低腸道中該酶的活性，說明添加合適劑量的外源蛋白酶才利于促進內(nèi)源蛋白酶的分泌進而提高飼料利用，最后促進生長，與改善生長性能的最適蛋白酶添加劑量150 mg/kg一致，過高的蛋白酶添加劑量反而會抑制腸道蛋白酶的活性而導(dǎo)致生長下降，添加200 mg/kg蛋白酶組增重率均較低劑量組下降也說明了這點。試驗結(jié)果顯示，中華草龜腸道中脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶的活性明顯高于胃和肝臟，這也進一步說明中華草龜對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收主要發(fā)生在腸道中。

4 結(jié)論

綜上所述，本試驗條件下，飼料中添加蛋白酶可改善中華草龜生長性能、形態(tài)學(xué)指標(biāo)和蛋白酶活性，添加150 mg/kg的蛋白酶在提高生長性能、形態(tài)學(xué)指標(biāo)以及胃腸道消化酶活性方面都優(yōu)于200 mg/kg的蛋白酶組。其促生長的原因可能是外源性蛋白酶通過提高中華草龜腸道胰蛋白酶的活性、增加草龜對蛋白質(zhì)的消化利用率，增加背甲寬、殼高進而增加其體增重。