李 戀，沈曉玲，張明昱, 包麗麗，納仁高娃

呼吸鏈由4個功能相對獨立的蛋白復合物組成，復合物Ⅰ是電子轉(zhuǎn)運鏈上最大、最復雜的酶。真核生物中，復合物Ⅰ由45個不同的蛋白亞基構成，其中僅7個蛋白由線粒體基因編碼，包括重要亞基ND5，其余由核基因編碼[1]。線粒體基因無組蛋白保護,易受到環(huán)境中高濃度氧化物損傷而突變，有研究[2-3]證明線粒體突變會降低NADH脫氫酶活性，使細胞供能失衡引起疾病。線粒體突變與MELAS綜合征[4]、帕金森病[5]、腫瘤[6]等有關，甚至與腫瘤發(fā)生發(fā)展及預后相關[7]。細菌[8]、哺乳動物[9-10]復合物Ⅰ的結構已解析，但人細胞中復合物Ⅰ的重要亞基ND5結構及功能沒有詳細報道。該研究采用生物信息學方法預測、比較分析正常細胞和BGC823中ND5差異, 為深入探究ND5基因突變與胃癌關系奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料通過基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取得到的BGC823總DNA。

1.2方法

1.2.1PCR反應并測序 設計兩對引物擴增ND5(1-2)、ND5(3-4)兩個片段，擴增體系(50 μl)：DNA模板100 ng，dNTP(2.5 mmol/L)3 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μl，10×Buffer 5 μl，Taq酶0.5 μl，超純水補足體積至50 μl。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，進入熱循環(huán)：94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)。

表1 擴增ND5基因引物表

PCR產(chǎn)物ND5(1-2)、ND5(3-4)兩個片段在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，檢測條帶特異性并切膠純化后由奧科生物技術公司和華大基因測序。

1.2.2生物信息學比較分析 ProtParam用于分析ND5蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；用EASE-MM分析穩(wěn)定性；采用ProtScale 、TMHMM預測蛋白質(zhì)的親/疏水性和跨膜區(qū)；借助PredictProtien和Swiss-Model在線預測軟件對蛋白質(zhì)的二級和三級結構進行預測分析，用Swiss-Pdb Viewer Manual v3.7軟件分析點突變對ND5三級結構的影響。

2 結果

2.1胃癌細胞BGC823中ND5基因突變情況用引物ND5(1-2)、ND5(3-4)PCR擴增、測序后拼接可以獲得ND5基因全長。以修正劍橋參考序列(rCRS:NC.012920)為對照，rCRS作為正常細胞線粒體ND5基因，分析比較獲得BGC823細胞的ND5基因，將該細胞中與rCRS序列有差異的位點見表2。經(jīng)分析氨基酸改變情況，BGC823細胞中在12835、13105位點處發(fā)生了錯義突變。

表2 BGC823細胞中ND5基因突變位點

注：G-A 代表rCRS該位點堿基G，但BGC823細胞中為A；G-G/A 代表rCRS該位點堿基G，但BGC823細胞中同時存在G和A

2.2人ND5蛋白的理化性質(zhì)預測和分析借助ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預測網(wǎng)站對正常人ND5蛋白進行理化性質(zhì)預測，并與發(fā)生異質(zhì)性點突變的BGC823細胞中ND5蛋白進行比對。人線粒體ND5基因編碼603個氨基酸；相對分子質(zhì)量為67 026.51；人線粒體ND5蛋白等電點為9.14，說明ND5是堿性蛋白質(zhì)；哺乳動物ND5蛋白的半衰期達到了30 h，ND5蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)33.95，小于40，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。同時，平均疏水性預測結果顯示：0.589，表明是疏水蛋白質(zhì)。以上特點符合已報道的ND5蛋白的特性。對BGC823的ND5蛋白序列進行預測，顯示相對分子質(zhì)量為67 042.51；等電點相同；平均疏水性預測結果為0.584，說明點突變并未改變蛋白疏水性；ND5蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為34.9，雖然也低于40，但比正常ND5蛋白值稍高，說明突變降低蛋白穩(wěn)定性。進一步通過EASE-MM(http://sparks-lab.org/server/ease)在線預測12835和13105兩處位點發(fā)生的突變對ND5蛋白穩(wěn)定性的影響，結果顯示兩位的氨基酸的改變均很可能降低了該蛋白的穩(wěn)定性。

2.3預測與分析突變對ND5蛋白親水性/疏水性和跨膜區(qū)的影響使用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)在線預測的工具，對人ND5蛋白進行親水性/疏水性分析， 結果如圖1所示。ND5蛋白親水性的最強位點是29位的賴氨酸(Lysine，K)，分值為-2.622；疏水性最強的位點是257位的異亮氨酸(iosleucine，I)，分值為3.244。BGC823細胞中的ND5蛋白親水性的最強位點未改變，但疏水性最強的位點變?yōu)?26位的異亮氨酸(iosleucine，I)、127位的蘇氨酸(threonine，T)、257位的異亮氨酸(iosleucine，I)，分值均為3.211。最強疏水位點的增多可能改變蛋白表面的結合位點及疏水肽段分布。ProtScale預測結果見圖1，提示人ND5蛋白疏水肽鏈與親水肽鏈相間分布在整個氨基酸序列中，結合ProtParam 的預測結果，顯示ND5蛋白是疏水蛋白質(zhì)。

圖1 ND5蛋白的親水性/疏水性分析A：正常ND5蛋白結果；B：BGC823中ND5蛋白結果

利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)軟件對人ND5蛋白進行跨膜區(qū)分析，結果提示該蛋白為多次跨膜蛋白質(zhì)，該結果與ProtScale軟件預測結果一致。TMHMM預測ND5蛋白螺旋分別在35～57、85～107、120～137、141～160、172～191、211～233、245～267、272～294、301～320、325～347、368～387、407～429、450～472、482～504和583～602氨基酸之間，N 端在胞內(nèi)、C端在細胞外，見圖2。BGC823中ND5蛋白跨膜區(qū)分析結果與正常人ND5蛋白分析結果一致，說明該軟件分析顯示突變可能并未影響跨膜區(qū)的肽段分布，進一步在二級結構中使用其他軟件進行分析，以相互驗證。

2.4人ND5蛋白二級結構的預測和分析通過PredictProtien(https://www.predictprotein.org/)在線預測ND5蛋白的二級結構，結果見圖3A。該蛋白含有17個跨膜螺旋區(qū)和2個β-折疊區(qū)，螺旋區(qū)和β-折疊區(qū)的氨基酸比率分別為73.47%和2.65%，LOOP區(qū)氨基酸比率為23.88%，說明人ND5蛋白近3/4的氨基酸為螺旋結構。結果顯示91.71%的氨基酸殘基是疏水的，6.3%的氨基酸殘基是親水的，1.99%的氨基酸殘基介于兩者之間。

圖2 ND5蛋白的跨膜區(qū)域預測

BGC823中ND5蛋白的螺旋區(qū)與正常ND5蛋白有差別，見圖3B，在243～349位點區(qū)正常ND5蛋白形成三個螺旋區(qū)(243～268、270～319、320～349)，BGC823的ND5蛋白形成兩個螺旋區(qū)(243～319、321～348)；在381～389位點區(qū)BGC823的ND5蛋白預測結果中多出一個螺旋(385～386)；在389～431位點區(qū)BGC823的ND5蛋白預測分為兩段螺旋(389～402、404～431)；在529～580位點區(qū)BGC823的ND5蛋白預測分為三段螺旋(529～540、542～561、563～580)。兩者在跨膜螺旋區(qū)預測結果也有差異，BGC823中ND5蛋白在536～573位點區(qū)有兩段跨膜螺旋(536～553、557～573)，而正常ND5蛋白僅有一段跨膜螺旋(548～563)。同時，預測結果顯示，蛋白結合位點兩者有差別，BGC823的ND5蛋白比正常ND5蛋白預測結果中在438位點和575位點均多了一個蛋白結合位點，而在535位點少了一個蛋白結合位點。BGC823中ND5的螺旋區(qū)、β-折疊區(qū)和LOOP區(qū)的氨基酸比率沒有變化，但疏水氨基酸殘基比率降為91.04%，親水氨基酸殘基比率升高為6.47%，介于疏水和親水性之間的氨基酸殘基的比率為2.4%。可見BGC823中兩處氨基酸位點的改變影響了疏水肽段和蛋白結合位點的分布，對ND5蛋白二級結構有一定影響。

2.5人ND5蛋白三級結構的預測和分析Swiss-Model(https://www.swissmodel.expasy.org/)可利用同源建模的方法對一段未知的蛋白三級結構作預測。將人ND5蛋白序列輸入該在線預測平臺后，會自動選擇與輸入序列同源性最高的已知序列結構為建模主要參照結構，見圖4A，其中一個已知結構序列(SMTL ID：5xtc.1)同源性高達99.5%，此序列是由Guo et al[11]完成結構分析，他們研究組對人類電子傳遞鏈上的復合物Ⅰ結構進行了分析。人ND5蛋白構建模型的GMQE(全球模型質(zhì)量評估)分數(shù)為0.98,接近1,說明預測可靠性高。進一步分析人ND5蛋白的氨基酸序列與模型蛋白質(zhì)相似性波形圖，見圖4B, 預測結構的波形較穩(wěn)定且絕大部分的氨基酸殘基分值不低于0.6, 說明模型較趨近于真實情況。

為了進一步預測BGC823中具有兩處氨基酸改變位點的ND5蛋白三級結構是否有改變，使用 Swiss-Pdb Viewer Manual v3.7軟件進行分析。BGC823中ND5蛋白167位的丙氨酸(alanine，A)轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸(threonine，T),疏水氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水氨基酸,257位的異亮氨酸(Isoleucine，I)轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸(Valine，V)，將人ND5蛋白模型的167、257位點進行突變，正常ND5蛋白167位與171、163位分別形成氫鍵，BGC823中ND5蛋白167位與171、163和164位分別形成氫鍵，結果顯示167位點突變使新的氫鍵形成，見圖5。

圖3 人ND5蛋白的二級結構分析A：正常ND5二級結構分析結果；B：BGC823中ND5二級結構分析結果

圖4 ND5蛋白三級結構及其同源蛋白質(zhì)相似性波形圖A：人ND5蛋白預測的三級結構；B：ND5同源蛋白質(zhì)相似性波形圖

圖5 人ND5三級結構及突變前后167位氫鍵改變

A：ND5蛋白三級結構；B1：正常ND5蛋白167位點處氫鍵情況；B2：突變ND5蛋白167位點處氫鍵情況;圓圈為突變位點在ND5三級結構中的位置；黃色箭頭指向突變前后一致的化學鍵；紅色箭頭指向突變后出現(xiàn)的新化學鍵

3 討論

ND5基因位于線粒體染色體上，其編碼蛋白是組成復合物Ⅰ的重要亞單位。復合物I由跨膜臂和伸入線粒體基質(zhì)的親水臂兩部分組成，親水臂和跨膜臂連接呈L形。ND5位于跨膜臂上，是構成反向運轉(zhuǎn)樣質(zhì)子泵模式的核心亞基。復合物I的跨膜臂與親水臂連接，另一端與復合物IV結合，主要通過ND5與復合物IV中的COX7C蛋白亞基相互作用[10]。

本研究檢測胃癌細胞系中BGC823的ND5基因點突變情況，發(fā)現(xiàn)在12835和13105位點的突變會引起其翻譯蛋白在167和254位點的錯義突變。進一步通過生物信息學分析比較了正常ND5蛋白與BGC823中出現(xiàn)錯義突變的ND5蛋白在理化性質(zhì)、二級結構、三級結構的差異。經(jīng)ProtParam 和EASE-MM生物信息在線數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)BGC823中ND5基因的兩處突變很可能引起其蛋白穩(wěn)定性下降。雖然突變前后等電點均為9.14，但經(jīng)ProtScale軟件預測發(fā)現(xiàn)突變后的ND5蛋白最強疏水位點在蛋白序列126、127位點增加兩處。PredictProtien軟件預測結果顯示突變后的ND5蛋白二級結構中螺旋區(qū)分布與正常蛋白有差別且蛋白結合位點增加，這些改變很可能影響蛋白高級結構形成及蛋白活性。經(jīng)Swiss-Pdb Viewer Manual v3.7軟件預測在蛋白167位點突變后形成了新的氫鍵。兩處突變造成ND5蛋白的物理性狀和結構的改變，很可能影響該蛋白正常生物學功能。ND5基因突變與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預后的相關性已在不斷被證實。已有相關研究報道ND5基因突變在多種腫瘤組織中被檢測到，與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關。Chattopadhyay et al[12]在口腔癌患者中檢測ND5基因，找到的5處點突變和7處SNP與腫瘤生長有關。Li et al[13]建議將ND5基因13273位堿基缺失作為患乳腺癌高風險檢測的生物標記。Kabekkodu et al[14]發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中ND5基因的突變位點數(shù)較多，僅次于D-Loop基因。Li et al[15]高通量測序檢測乳腺癌患者血液中的線粒體基因突變，其中包括ND5基因在內(nèi)的一些線粒體基因突變可能被用作乳腺癌診斷的潛在標志物。

根據(jù)本研究結果，從發(fā)生機制上推測，很可能是由于ND5基因突變引起ND5蛋白結構改變，從而進一步影響復合物Ⅰ的活性，甚至可能影響與其他復合物結合活性，最終引起細胞的能量代謝失衡，而導致腫瘤發(fā)生或預后不良等問題。