宋曉菲，徐元宏

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)持續(xù)感染可導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化甚至是肝癌，嚴(yán)重危害人類健康。近期研究[1]揭示了微小RNA(miRNA)在HCV增殖和發(fā)病中的作用。微小RNA-122(miR-122)是肝臟中含量最豐富的miRNA，一些臨床研究[2-3]顯示miR-122與肝損傷相關(guān)，表現(xiàn)為和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-pyruvic transaminase，ALT)及乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV) DNA表達(dá)水平相關(guān)，因此miR-122也被認(rèn)為是一種新的肝損標(biāo)志物。外泌體是由細(xì)胞膜內(nèi)陷后通過(guò)一系列復(fù)雜的機(jī)制形成的微囊泡結(jié)構(gòu)，外泌體中包含蛋白質(zhì)、脂肪及核酸,雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)可以保護(hù)這些內(nèi)容物不被酶所降解,外泌體是細(xì)胞間信息交流傳遞的重要載體[4]。存儲(chǔ)在外泌體中的循環(huán)miRNA具有足夠的穩(wěn)定性，該研究的主要目的是檢測(cè)HCV患者中血清外泌體中的miR-122的表達(dá)水平，探討miR-122是否能作為HCV患者肝損的標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2017年1月～2018年1月在無(wú)錫市第二人民醫(yī)院篩查出HCV感染者40例，診斷符合《丙型肝炎防治指南》[5]，其中男22例，女16例，年齡18.0～67.0歲(中位年齡42.8歲)。其中28例基因分型為HCV-1b，非HCV-1b共計(jì)12例(HCV-2a，HCV-3a，HCV-3b和HCV-6a)。其他原因的肝臟損害疾病排除在外，包括乙肝、丁肝、戊肝、己肝、合并艾滋病、肝硬化、肝癌等。所有患者接受了以聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林為基礎(chǔ)的治療。選了20例健康體檢者作為對(duì)照組，其中男12例，女8例，年齡20.1～70.0歲(中位年齡46.0歲)。所有患者接受了以聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林為基礎(chǔ)的治療，按照療效分為持續(xù)病毒應(yīng)答組 (sustained virological response, SVR)和非持續(xù)性病毒應(yīng)答組(non-sustained virological response, NR)，前者為接受治療后獲得了持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答或完全清除了丙肝病毒，后者為治療后未獲得病毒應(yīng)答或一直持續(xù)高病毒水平。所有研究對(duì)象均知情并簽署了知情同意書。每位研究對(duì)象采集2～3 ml靜脈血。

1.2儀器和主要試劑Real-Time PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司；低溫離心機(jī)、移液器購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；馬爾文NanoSight NS300納米顆粒跟蹤分析儀購(gòu)自英國(guó)Malvern Instruments 公司， CD63、CD9、TSG-101抗體、抗-HCV診斷試劑盒，HCV核酸定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海釋物生物科技有限公司； RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；miR-122實(shí)時(shí)定量PCR引物、丙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法)購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物有限公司；PVDF filter 購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.3miR-122熒光定量PCR用RNA提取試劑盒提取血清中的microRNA，RNA逆轉(zhuǎn)錄采用Taqman microRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和miRNA特異性莖環(huán)引物，具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：5 μl RNA，2 μl逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.25 μl dNTP(100 mmol/L),4 μl 逆轉(zhuǎn)錄引物(1 μmol/L),0.5 μl逆轉(zhuǎn)錄酶(50 U/μl)，0.25 μl Rnase抑制劑(20 U/μl)，12 μl RNAase-free去離子水；反應(yīng)條件：16 ℃、30 min； 42 ℃、30 min； 85 ℃、5 min。采用Taqman microRNA定量PCR試劑盒對(duì)miR-122進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，引物、反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[6]，采用U6為內(nèi)參，標(biāo)準(zhǔn)化CT：ΔCt=CTmiR-122-CTU6。血漿中miR-122的含量使用2-ΔΔCT法計(jì)算，ΔΔCT=(CTmiR-122-CTU6)實(shí)驗(yàn)組-(CTmiR-122-CTU6)對(duì)照組。

1.4外泌體的分離鑒定血清預(yù)先用0.22 μm PVDF filter 過(guò)濾，按照文獻(xiàn)[7]超速離心的方法收集外泌體，提取的外泌體利用電鏡負(fù)染的方法觀察其形態(tài)，利用NanoSight NS300 進(jìn)行外泌體大小測(cè)定和定量分析。利用Western blot 檢測(cè)外泌體表面標(biāo)志性marker-CD63、CD9和腫瘤易感基因 101 蛋白(TSG-101)等方法對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1HCV患者的一般臨床特征兩組的一些常規(guī)的生化指標(biāo)，包括血清白蛋白(Alb)、總膽紅素(TBIL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)以及其他各項(xiàng)指標(biāo)如白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、葡萄糖(GLU)、乳酸脫氫酶(LDH)、高密度脂蛋白(HDL)等。Alb、TBIL、LDL在HCV患者中較健康人水平下降，而ALT、AST水平在HCV患者中較健康人升高，WBC、RBC、GLU、LDH、HDL等其他指標(biāo)在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2血清外泌體分離鑒定在HCV患者和對(duì)照組提取的血清外泌體中檢測(cè)到CD63、CD9和TSG-101，提示血清外泌體提取成功(圖1)。

圖1 HCV患者和健康對(duì)照者的血清外泌體標(biāo)志物CD63、CD9和TSG-101表達(dá)

2.3HCV患者和健康對(duì)照組中血清外泌體miR-122的表達(dá)水平HCV組血清外泌體中miR-122的表達(dá)量均較健康對(duì)照明顯降低，但是HCV-1b組的miR-122表達(dá)量比非HCV-1b組略高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2A。 HCV組(包括HCV-1b和非HCV-1b組)中外泌體miR-122的表達(dá)量與AST和ALT之間的相關(guān)性：HCV組中miR-122的表達(dá)量與AST的相關(guān)系數(shù)r=-0.22, miR-122表達(dá)量與ALT的相關(guān)系數(shù)r=-0.29，提示HCV組中miR-122的表達(dá)量與AST或ALT的表達(dá)量負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性弱。

2.4HCV患者和健康對(duì)照組中血清循環(huán)miR-122的表達(dá)水平血清循環(huán)miR-122的水平見圖2B。HCV-1b和非HCV-1b組的血清循環(huán)miR-122表達(dá)量較健康人降低，同樣的，HCV-1b組的血清循環(huán)miR-122表達(dá)比非HCV-1b組的表達(dá)高(P<0.05)，見圖2。HCV患者中(包括HCV-1b和非HCV-1b組)血清循環(huán)miR-122和ALT、AST相關(guān)性顯示：血清循環(huán)miR-122和ALT、AST呈負(fù)相關(guān)，前者相關(guān)系數(shù)r=-0.522，后者相關(guān)系數(shù)r=-0.39。

表1 HCV患者(HCV-1b和非HCV-1b)和健康對(duì)照組一般情況比較

P1：HCV-1b組與健康對(duì)照組比較;P2：非HCV-1b組與健康對(duì)照組比較

圖2 HCV-1b組、非HCV-1b組和健康對(duì)照組的血清外泌體miR-122和血清循環(huán)miR-122表達(dá)量

A：三組中血清外泌體miR-122的表達(dá)量；B：三組中血清循環(huán)miR-122的表達(dá)量；非HCV-1b組與健康對(duì)照組比較：*P<0.05；HCV-1b組與健康對(duì)照組比較：&P<0.05；非HCV-1b組與HCV-1b組比較：#P<0.05

2.5不同基因型患者miR-122表達(dá)水平與療效初步分析本研究的28例HCV-1b型患者，其中20例為SVR，其余為NR；12例非HCV-1b型患者中，有4例為SVR，其余為NR。 計(jì)算SVR的患者和NR患者血清循環(huán)和血清外泌體miR-122表達(dá)量， 血清循環(huán)miR-122在SVR患者中表達(dá)量明顯高于NR患者(P<0.05)，但血清外泌體miR-122在SVR患者和NR患者中表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

3 討論

血清循環(huán)miR-122被認(rèn)為是一種新的預(yù)測(cè)肝功能損傷的生物標(biāo)志物[8-12]。本研究中，HCV患者血清循環(huán)miR-122的表達(dá)量較正常人降低，并與AST和ALT表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。目前關(guān)于HCV患者血清循環(huán)miR-122的表達(dá)趨勢(shì)尚有爭(zhēng)議，張慶 等[13]和Bihrer et al[14]研究顯示慢性HCV感染者血清循環(huán)miR-122表達(dá)高于健康對(duì)照組，而Jiao et al[15]研究表明血清和外泌體中miR-122在各個(gè)丙肝基因型組中均低于對(duì)照組，造成這樣的原因?yàn)檫@幾個(gè)研究納入患者和樣本量大小不一樣，張慶 等[13]的研究主要納入的為慢性丙肝、肝硬化、肝癌患者，Bihrer et al[14]主要納入的也為慢性丙肝患者，本研究和Jiao et al[15]研究納入的患者群并非限定在慢性丙肝感染，可能在丙肝進(jìn)程的不同階段miR-122表達(dá)量會(huì)不同，后續(xù)研究中也會(huì)關(guān)注這點(diǎn)。

圖3 SVR組和NR組的血清外泌體miR-122和血清循環(huán)miR-122表達(dá)

A：血清泌體miR-122的表達(dá)；B：血清外循環(huán)miR-122的表達(dá)；與SVR患者比較：*P<0.05

外泌體是一種穩(wěn)定有效的細(xì)胞間信號(hào)傳遞和交換方式，包含蛋白質(zhì)、信使RNA和微小RNAs等，這些內(nèi)容物在外泌體的保護(hù)下不易被降解[16]。在本研究中，外泌體源性miR-122與血清循環(huán)miR-122表達(dá)趨勢(shì)類似(消長(zhǎng)一致)，在HCV患者中表達(dá)水平低于健康人群，此外，外泌體源性miR-122與AST和ALT之間也存在著負(fù)相關(guān)，只是負(fù)相關(guān)性比血清循環(huán)miR-122和AST/ALT弱。這些結(jié)果提示外泌體源性miR-122雖然穩(wěn)定性比血清循環(huán)miR-122穩(wěn)定，但是準(zhǔn)確性上可能不如血清循環(huán)miR-122。

臨床HCV治療方案主要為干擾素和利巴韋林，但療效差異較大， HCV最常見有5種基因型(1a、1b、2a、3a、6a)，我國(guó)主要為以1b型最多見(約占70%)，有研究[15]認(rèn)為不同基因型HCV與疾病嚴(yán)重程度有一定相關(guān)性。本研究觀察到HCV不同基因型之間的血清循環(huán)和血清外泌體中的miR-122表達(dá)量存在差異，HCV-1b組miR-122表達(dá)量略高于非HCV-1b組，這與Jiao et al[15]的研究結(jié)果基本一致。也有研究[14]報(bào)道m(xù)iR-122可作為HCV治療成功的預(yù)后標(biāo)記，本研究也對(duì)此進(jìn)行了初步的探討，SVR為治療有效，而NR則為效果不佳，本研究結(jié)果提示，獲得SVR的患者血清循環(huán)miR-122高于NR的患者，但是血清外泌體miR-122在SVR組和NR組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示血清外泌體miR-122可能不具備預(yù)測(cè)治療效果的可能性。但是治療效果的影響因素眾多，即便是血清循環(huán)miR-122在SVR組和NR組之間存在差異，血清循環(huán)miR-122預(yù)測(cè)治療效果的能力仍有待深入探討。