王海芳，何 銳，成 雅，袁瑞華，董 靜，劉勤社△

(1.陜西省及咸陽市中西醫(yī)結(jié)合心血管病防治重點實驗室，陜西中醫(yī)藥大學，陜西 西安 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學真實世界臨床研究院，陜西 西安 712046；3.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西 西安 712000)

應用抗血小板藥物預防和抑制血栓形成是血栓栓塞性心腦血管病和血管支架置入圍手術(shù)期的重要治療措施[1]。然而目前所有的抗血小板治療多伴有出血風險增加，隨著用藥時間的延長及抗栓藥物聯(lián)用，出現(xiàn)藥物抵抗、消化道損傷等不良反應的幾率也大大增加[2]。因此，深入研究血小板功能的調(diào)控機制，尋找新的安全有效的抗血小板藥物，成為當今心腦血管疾病防治領(lǐng)域的國際性關(guān)注點[3]。國外學者從血小板結(jié)構(gòu)和功能調(diào)控的角度進行了深入的研究，我國眾多學者則從中藥入手開展研究尋找抗血小板活性成分，均取得了一定的成果。本文將從血小板膜表面黏附受體及其表達的調(diào)控，以及中藥活性物質(zhì)對其影響的角度對近年來的研究進展進行綜述。

1 血小板表面黏附受體GPIb-IX-V復合物和GPIbα

除止血外，血小板在免疫、炎癥、腫瘤轉(zhuǎn)移等方面也具有重要作用[4]。在損傷修復或粥樣硬化斑塊形成過程中，血小板對受損或活化血管內(nèi)皮的識別和黏附起著關(guān)鍵性作用。通過一系列高度整合的過程，血小板從快速移動狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樵谑軅课痪徛凉L動、黏附和激活，再募集更多血細胞形成血栓。血小板與血管內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮下基質(zhì)、白細胞等的黏附主要由血小板表面黏附-信號傳遞受體介導，這些受體多為糖蛋白（glycoprotein，GP），其中 GPIbα 尤為重要[5]。

GPIb-IX-V復合物是血小板表面最重要的黏附受體，GPIbα與GPIbβ以二硫鍵相連接，再與GPIX和GPV非共價連接組成GPIb-IX-V。GPIbα的細胞外N-末端是其配體結(jié)合區(qū)域。血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF） 是 GPIb-IX-V 復合物的主要配體之一。在血液流體剪切力作用下，一端固定的vWF結(jié)構(gòu)部分展開，功能結(jié)構(gòu)域暴露，與GPIbα的N-末端相互作用，GPIbα胞外區(qū)域還有感知流體剪切應力并影響vWF與GPIbα結(jié)合的功能，故vWF與GPIb-IX-V復合物之間的結(jié)合對血流變化非常敏感[6]。vWF還可同時與膠原纖維和血小板結(jié)合。血管破裂時，大量血小板以vWF為中介黏附在膠原纖維上形成血栓。因此，GPIbα的胞外域N-末端是血栓形成所必需。此外，凝血因子XI和XII、凝血酶、白細胞整合素αMβ2、P-selectin等許多其它分子也能結(jié)合到此部位，在凝血和先天免疫應答中發(fā)揮重要作用[7]。

GPIbα胞外域還可通過影響膠原纖維與其受體GPVI的結(jié)合來調(diào)節(jié)血小板活化的速度和程度[7]。GPIb-IX-V復合物和GPVI與其各自配體的結(jié)合可協(xié)調(diào)血小板對裸露內(nèi)皮下基質(zhì)的反應性。研究表明，GPIbα也參與血小板存活的調(diào)節(jié)，抗體或寒冷誘導GPIbα在血小板表面上聚集成簇或形成二聚體可導致循環(huán)血小板被迅速清除[8]。因此，保證血小板膜上GPIbα的相對密度和功能對于維持血小板的黏附聚集功能和激活效率極為重要[9]。血小板膜受體已成為血小板相關(guān)疾病治療藥物研究與設(shè)計的重要靶點[10]。

2 ADAMs家族成員對血小板黏附受體的調(diào)控

循環(huán)血小板膜受體水平和功能如何精細調(diào)節(jié)，目前仍未完全闡明。有核細胞可通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的方式進行受體更新，但血小板中不存在此機制。在金屬蛋白酶的作用下，胞外結(jié)構(gòu)域發(fā)生水解脫落（ectodomain shedding）是一種快速、不可逆的膜蛋白調(diào)控機制。胞外域脫落現(xiàn)象存在于許多細胞類型，對多種細胞生物學過程進行調(diào)節(jié)，是一種高效率蛋白質(zhì)翻譯后調(diào)控機制。去整合素金屬蛋白酶家族（A Disintegrin And Metalloproteinases，ADAMs）是胞外域剪切脫落的主要承擔者，ADAM17是其最為重要的成員，被稱為細胞中的“分子剪刀”[11]。

ADAM17是一種I型金屬蛋白酶，其最著名的底物分子為pro-TNF-α，作用后釋放出游離TNF-α，故又稱為TNF-α轉(zhuǎn)化酶（tumor necrosis factor-α converting enzyme，TACE）。目前已知ADAM17底物超過80種，包括多種細胞因子、生長因子、受體或黏附分子等，因此在機體發(fā)育、炎癥和疾病過程中發(fā)揮重要作用[12]。ADAM17因釋放TNF-α而誘發(fā)炎癥反應，并可誘導表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的配體脫落而激活EGFR信號、維持表皮屏障功能，是機體抵御損傷和感染的第一道防線。ADAM10是ADAMs家族中另一個重要成員，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有重要作用[13]。ADAM17和ADAM10的底物存在一定的交叉，可發(fā)生功能代償現(xiàn)象[14]。研究表明，血小板膜受體GPIbα的水平主要受ADAM17的調(diào)控，ADAM10主要作用于GPVI[15]。

GPIb-IX-V復合物和GPVI與其各自相應配體結(jié)合，激活血小板內(nèi)信號通路后，隨即迅速引起GPIbα和GPVI的胞外配體結(jié)合片段發(fā)生不可逆的剪切脫落，避免了血小板的過度激活。Bergmeier等報告，ADAM17對人血小板受體GPIbα在細胞外近膜區(qū)進行剪切后產(chǎn)生大小約110-130kDa的可溶性GPIbα 片段（glycocalicin，GC）[16]，但其功能不明。研究顯示，在ADAM17基因表達抑制的LDLR-/-小鼠中，喂食高脂肪飲食形成的動脈粥樣硬化病變的面積明顯增大[17]，不過并未出現(xiàn)明顯的凝血障礙，可能與存在其他代償機制有關(guān)。

3 ADAM17的激活

ADAM17蛋白的分子結(jié)構(gòu)組成包含一個N末端信號序列、一個前結(jié)構(gòu)域、一個金屬蛋白酶或催化結(jié)構(gòu)域、一個解整合素結(jié)構(gòu)域、一個富含半胱氨酸的膜近端結(jié)構(gòu)域、一個單次跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)部分，各部分結(jié)構(gòu)在ADAM17的成熟、轉(zhuǎn)位、活性調(diào)控和底物選擇性方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。ADAM17的激活是一個受到嚴密調(diào)控的過程。ADAM17前蛋白的修飾、其磷酸化和向細胞膜的轉(zhuǎn)位，都是影響酶活性的重要因素。在不同細胞類型進行的研究中，PKC、ROS、鈣離子、p38 MAPK，以及 ERK、AKT等均報告有參與ADAM17的激活和對底物的剪切作用。

在非血小板細胞上進行的研究表明，PMA激活PKC可促使成熟ADAM17向細胞膜表面移動；在血小板中則可增強血小板表面ADAM17的活性。PKC可誘導ADAM17的磷酸化；PKC的許多不同亞型參與ADAM17激活，可能與細胞類型有關(guān)[18]。

Brill等報告，在體外以過氧化氫誘導血小板氧化應激，可激活ADAM17并誘導GPIbα胞外剪切脫落，機制研究顯示這種ADAM17激活作用依賴于p38 MAPK信號，而與血小板活化、PKC、PI3K和凋亡信號通路無關(guān)，提示氧化應激是激活ADAM17、影響血小板受體，對其聚集功能進行調(diào)控的一種機制[19]。血小板儲存病變指的是血小板儲存過程中受體脫落和耗竭、使得輸血后血小板的存活率和功能都顯著下降，也與線粒體損傷引起p38 MAPK的磷酸化激活有關(guān)[20]。

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）在血小板活化或凋亡中起關(guān)鍵作用，mPTP抑制劑對鈣離子載體A23187誘導的GPIbα胞外脫落發(fā)揮抑制作用，而mPTP增效劑則可具促進作用。此外，A23187誘導的線粒體Ca2+升高可引發(fā)mPTP開放，促進線粒體ROS產(chǎn)生，后者誘發(fā)ADAM17介導GPIbα胞外域脫落[21]。Zhang等[22]也報告，膠原蛋白、凝血酶和A23187都能誘導血小板ROS產(chǎn)生，同時引起GPIbα胞外域脫落，ROS清除劑抑制GPIbα脫落。在小鼠成纖維細胞和CHO細胞中，ATP激活 P2Y受體、誘導 ADAM17-依賴性TGF-α釋放、激活EGFR信號，線粒體ROS和Ca2+也發(fā)揮重要作用[23]。

最近研究發(fā)現(xiàn)，iRhom（protease-inactive rhomboids）家族成員iRhom1和 iRhom2是ADAM17的重要調(diào)節(jié)分子，在分泌途徑中ADAM17的運輸需要與iRhom2相結(jié)合。iRhom2磷酸化與ADAM17對底物的酶解活性也有關(guān)系，可能還參與對底物的選擇作用。血小板中僅發(fā)現(xiàn)有iRhom2表達，故通過作用于iRhom2而激活ADAM17可能是開發(fā)選擇性地作用于血小板的藥物的一個切入點[24]。Chapnick等[25]研究認為ADAM17的激活機制具有明顯的細胞類型特異性。

4 內(nèi)外源性物質(zhì)通過影響ADAM17而調(diào)節(jié)血小板及其他細胞的功能

最早報告可直接影響血小板受體表達的藥物正是抗血小板藥物阿司匹林，其在高劑量下可體外誘導血小板GPIb和GPV脫落；同時阿司匹林也可誘導中性粒細胞表面L-selectin脫落，這些作用都依賴于其對ADAM17的激活[26]。

Duerschmied等報告，5-羥色胺 （5-hydroxytryptamine，5-HT）與血小板膜5-HT2AR結(jié)合后可誘導血漿和細胞培養(yǎng)上清中脫落的GPIbα胞外片段含量升高，而在 ADAM17 基因敲除（ADAM17ΔZn/ΔZn）血小板中，5-HT的作用抑制，表明此作用由ADAM17介導；5-HT激活ADAM17的作用與p38有關(guān)，似與G蛋白無關(guān)[27]。Hirata等采用iPSC（induced pluripotent stem cells，人誘導多能干細胞）生產(chǎn)血小板過程中發(fā)現(xiàn)，利用KP-457抑制iPSC中ADAM17后產(chǎn)生的血小板GPIbα胞外脫落的程度較輕，血小板聚集功能更好[28]。

腸道內(nèi)皮細胞中毒蕈堿型乙酰膽堿M3型受體激活后，通過活化ADAM17而促使細胞膜TNFR1剪切脫落，抑制TNF-α對粘膜屏障的破壞，M3受體介導作用決于Gαq/11蛋白和p38，同時p38也參與了ADAM17介導的EGFR激活和ERK1/2激活，對于粘膜屏障發(fā)揮保護作用[29]。此外，angiotensin II、IL-1、ATP等也可激活特異性GPCR、ADAM17活性增強而調(diào)控EGFR等細胞內(nèi)信號?？梢哉f，ADAM17是GPCR介導信號的傳導者，也是細胞受體信號相互交流的關(guān)鍵分子。

組織金屬蛋白酶抑制劑（Tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）包括 TIMP 1-4，是體內(nèi)天然的金屬蛋白酶抑制劑，也是細胞膜蛋白脫落事件的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。TIMP-3是ADAM17的有效抑制劑，但TIMP3抑制ADAM17而產(chǎn)生的確切后果尚不明確[30]。

5 活血化瘀中藥對ADAM17的調(diào)控

血瘀證是心血管病常見的中醫(yī)證型，同時可見于幾乎所有西醫(yī)疾病的部分病程階段、甚至全過程。從西醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學的角度看，血瘀證的主要病理表現(xiàn)是血液循環(huán)障礙，包括血液流變學異常、血流動力學改變、凝血亢進、血小板活化聚集、血栓形成和血管腔狹窄等，而形成血瘀證后又可引發(fā)多種更為嚴重的病變。中醫(yī)認為其病機主要是瘀血內(nèi)阻，治以活血化瘀。臨床上，活血化瘀法治療心血管系統(tǒng)疾病，特別是作為冠心病[31]和病理性血栓形成[32]的輔助用藥，療效頗佳。

常用活血化瘀中藥有赤芍、川芎、丹參、紅花、桃仁、乳香、沒藥等，常同補氣、養(yǎng)血、溫經(jīng)散寒、清熱、行氣、攻下等治法配合使用。例如，陳可冀院士治療冠心病支架置入術(shù)后血瘀證常用赤芍、川芎、紅花和丹參[31]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，活血化瘀藥物治療心血管疾病的機制主要包括：（1）抗血小板聚集；（2）改善血管內(nèi)皮功能；（3）調(diào)節(jié)炎癥因子表達；（4）抑制氧化應激；（5）調(diào)脂、穩(wěn)定斑塊；（6）增加冠狀動脈血流量[33]。可見抗血小板聚集是活血化瘀藥物發(fā)揮作用的一個重要方面，三七、紅花、川芎、益母草等中藥對血小板聚集的抑制作用已得到實驗驗證；活血化瘀中藥調(diào)控血小板功能的機制主要是抑制其與功能障礙的血管內(nèi)皮細胞之間的黏附，或可直接抑制血小板激活和聚集，然而其作用機制和作用靶點目前尚有待進一步闡明[34]。活血化瘀中藥是否可通過如前所述的ADAM17/GPIbα途徑調(diào)控血小板功能，目前尚未見報告。

血管內(nèi)皮功能失調(diào)是動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）形成的始動因素和必備條件，同時也與血小板黏附和血栓形成密切相關(guān)[35]。許多藥物可通過抑制氧化應激、調(diào)節(jié)炎癥因子表達、抑制細胞內(nèi)炎性信號通路等途徑而改善血管內(nèi)皮功能，抑制AS的發(fā)展。本課題組在前期開展國家自然科學基金項目“基于TACE剪切作用研究活血膠囊對動脈粥樣硬化的抗炎機制（81573823）”的過程中，研究了活血膠囊及某些中藥活性單體對血管內(nèi)皮細胞的抗炎機制，發(fā)現(xiàn)紅花主要活性成分羥基紅花黃色素（hydroxyl-safflower yellow A，HSYA）、赤芍主要活性成分芍藥苷（paeoniflorin，PF）、黃芪中所含黃芪皂苷 III（astragalaside III，AS-III），以及活血膠囊均可誘導血管內(nèi)皮細胞中的ADAM17酶活性升高。HSYA激活ADAM17后引起細胞膜TNFR1剪切脫落，抑制細胞中TNFR1/NF-κB信號激活和黏附分子-1（ICAM-1）的表達，進而抑制巨噬細胞和內(nèi)皮細胞黏附[36]。PF激活內(nèi)皮細胞ADAM17后，不僅引起TNFR1剪切脫落和NF-κB信號抑制，還介導EGFR反式激活及下游保護性信號激活，發(fā)揮抗氧化和抗炎作用；PF通過誘導ADAM17磷酸化而使之激活[37]。在動脈平滑肌細胞中，我們發(fā)現(xiàn)AS-III可抑制TNFR1/NF-κB信號激活[38]；隨后研究顯示，AS-III的作用也與激活ADAM17、誘導TNFR1脫落有關(guān)，且同時可誘導EGFR反式激活；進一步研究表明AS-III通過激活p38而誘導ADAM17磷酸化。與此同時，我們發(fā)現(xiàn)活血膠囊也可誘導血管內(nèi)皮細胞中ADAM17磷酸化，激活EGFR信號和抑制TNFR1/NF-κB信號（數(shù)據(jù)待發(fā)表）。以上研究提示，ADAM17是活血化瘀藥物抑制血管內(nèi)皮細胞炎癥，進而抑制內(nèi)皮細胞與白細胞、血小板黏附，發(fā)揮對心血管“活血化瘀”作用的一個重要靶點。

黃芪是一味重要的益氣活血中藥。除本課題組對AS-III的研究外，Gu等[39]報告，黃芪甲苷（AS-IV）可激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2而誘導抗氧化酶血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）等抗氧化酶的表達，其作用機制與誘導HB-EGF釋放、反式激活EGFR信號有關(guān)。Chen等[40]也報告，AS-VI具有促進神經(jīng)干細胞增殖和自我更新的功能，其作用與激活EGFR/MAPK信號通路有關(guān)。盡管上述研究并未對AS-VI誘導HB-EGF釋放或EGFR激活的機制進行深入研究，筆者推測可能與激活ADAM17或其類似物有關(guān)。本課題組研究顯示，活血膠囊亦可誘導PI3K/AKT/Nrf2/HO-1信號通路激活，從而對血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮抗氧化作用[41]；同時發(fā)現(xiàn)活血膠囊可誘導血管內(nèi)皮細胞中ADAM17活化，而且PI3K/AKT/Nrf2的激活可為ADAM17抑制劑所抑制（數(shù)據(jù)待發(fā)表），提示ADAM17是活血膠囊激活抗氧化信號通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

以上研究顯示，血管內(nèi)皮細胞中的ADAM17可為活血化瘀中藥單體或復方活血膠囊激活，通過切割細胞表面的炎癥相關(guān)分子TNFR1、EGFR受體來發(fā)揮抗炎作用，那么這些藥物是否可以同時激活血小板中ADAM17，通過對GPIbα途徑發(fā)揮切割作用、減少其配體結(jié)合位點而抑制血小板黏附聚集功能，發(fā)揮“活血化瘀”作用，是一個非常令人感興趣的問題。課題組的前期研究顯示，在離體血小板中，HSYA、PF和活血膠囊的確可迅速誘導GPIbα的胞外片段脫落至培養(yǎng)液中（數(shù)據(jù)待發(fā)表），其進一步的作用機制和生理學意義正在研究中。

由于ADAM17在體內(nèi)幾乎所有細胞廣泛表達，底物又十分多樣[42]，因此在不同細胞類型中ADAM17激活后產(chǎn)生的效應與細胞的功能密切相關(guān)[43-44]。筆者推測，激活內(nèi)皮細胞中的ADAM17，誘導TNFR1和其他炎性分子如（Toll-Like Receptor 4，TLR4）脫落而抑制炎癥反應[44]；同時激活血小板 ADAM17，誘導GPIbα脫落，抑制血小板黏附功能，進一步影響血小板與血管、白細胞、腫瘤細胞等的相互作用，可能是活血化瘀藥物發(fā)揮作用的兩個方面。血小板ADAM17很可能是中藥活血化瘀作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。