余 倩 姜立新

胰腺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響腫瘤患者長期存活的最主要因素，在轉(zhuǎn)移的過程中，原發(fā)腫瘤細(xì)胞可通過多種途徑侵入到血液循環(huán)系統(tǒng)中，產(chǎn)生循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (CTCs)。這些細(xì)胞以單個(gè)或聚集成團(tuán)的形式存在，部分CTCs作為腫瘤轉(zhuǎn)移的種子，在脫離原發(fā)病灶后能夠抑制失巢凋亡，在血液循環(huán)中抵抗流體剪切力和躲避免疫監(jiān)視，具有在機(jī)體其他部位附著形成新的癌轉(zhuǎn)移灶的潛能[1]。CTCs有原發(fā)灶細(xì)胞的生物學(xué)特性，因此被認(rèn)為在反映癌癥惡性程度及預(yù)后方面有重要的應(yīng)用潛能。研究表明，CTCs的檢測(cè)結(jié)果、細(xì)胞計(jì)數(shù)、特定表面標(biāo)志物識(shí)別與胰腺癌患者的診斷及分期、療效判斷和預(yù)后顯著相關(guān)，能夠?yàn)橐认侔┑膫€(gè)體化診療提供可靠依據(jù)[2]。

一、胰腺癌CTCs體外檢測(cè)

胰腺癌CTCs進(jìn)入血液循環(huán)后，絕大部分會(huì)受到失巢凋亡，流體剪切力和機(jī)體免疫識(shí)別殺傷作用的影響，最終在外周血中存活的CTCs數(shù)量稀少(約每109～1010個(gè)血細(xì)胞中有1～10個(gè)CTCs)。體外檢測(cè)又被稱為“液體活檢”，主要通過采集血樣，對(duì)CTCs進(jìn)行計(jì)數(shù)及亞群特征分析。主要的分離檢測(cè)方法可分為免疫介導(dǎo)法和分子法(主要為PCR介導(dǎo)的檢測(cè))兩大類[3]。此外，利用密度梯度離心和基于細(xì)胞尺寸的物理法分離，可對(duì)血樣中微量的CTCs進(jìn)行富集，從而提高檢測(cè)敏感度[4]。

1.免疫介導(dǎo)法檢測(cè)胰腺癌CTCs：基于抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的免疫學(xué)方法以其特異性、有效性，在胰腺癌CTCs檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用。胰腺癌為上皮組織來源腫瘤，在其細(xì)胞表面表達(dá)特殊的表面分子，而血液中的紅細(xì)胞和白細(xì)胞則幾乎不表達(dá)上皮來源的表面分子。最常見的選擇性標(biāo)志物為上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)。

CellSearch系統(tǒng)是唯一受美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的，用于患者體內(nèi)CTCs分離檢測(cè)的技術(shù)，該技術(shù)是一種自動(dòng)化的CTCs免疫富集和染色的系統(tǒng)。檢測(cè)過程中，偶聯(lián)有EpCAM抗體的磁珠捕獲CTCs，通過磁珠分選將其富集[5]。然后固定富集的細(xì)胞并用DAPI、CK和CD45染色，通過CellSpotter分析儀(Veridex)將CK+、DAPI+、CD45-細(xì)胞計(jì)數(shù)為CTCs。

Hugenschmidt等[6]通過CellSearch系統(tǒng)檢測(cè)可切除的胰腺癌和壺腹周圍癌患者外周血CTCs與疾病預(yù)后，結(jié)合患者術(shù)后病理分析，高風(fēng)險(xiǎn)患者CTCs陽性(≥1/7.5ml)占6.8%(10/147)，晚期患者CTCs陽性占6.2% (2/33)，低風(fēng)險(xiǎn)和良性腫瘤患者CTCs均為陰性，盡管成功切除腫瘤，但術(shù)前CTCs陽性的患者仍顯示出不良預(yù)后。Okubo等[7]通過CellSearch系統(tǒng)檢測(cè)不可切除的胰腺癌患者外周血CTCs與疾病預(yù)后，CTCs陽性患者(21/65)總生存率明顯低于陰性患者，且伴有肝轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者CTCs數(shù)量明顯增多，研究表明CTCs可預(yù)測(cè)晚期胰腺癌患者化療預(yù)后和治療反應(yīng)。

微流體芯片技術(shù)(CTC-Chip)是基于EpCAM陽性選擇的另一種檢測(cè)方式，Nagrath等[8]于2007年首次報(bào)道，CTC-Chip由一系列具有EpCAM抗體的微柱組成，當(dāng)外周血樣本流過芯片時(shí)，因抗原-抗體反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞被芯片捕獲。Ko等[9]研制的CTCs熒光原位雜交芯片可實(shí)現(xiàn)分離并檢測(cè)全血中的CTCs，該芯片將胰腺癌CTCs定義為RNA FISH(CK18+、CK19+、Ctnnd1+、CD45-)，并應(yīng)用于胰腺癌小鼠模型及25例晚期胰腺癌患者血液標(biāo)本中。

以上兩種基于EpCAM陽性選擇的胰腺癌CTCs檢測(cè)方式也存在一定的局限性，由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等特性，并非所有腫瘤細(xì)胞都表達(dá)EpCAM抗原，這有可能會(huì)降低CTCs檢測(cè)率。

免疫磁珠陰性富集可對(duì)胰腺癌CTCs進(jìn)行陰性選擇，將患者血樣中的紅細(xì)胞裂解后，通過使用表面帶有白細(xì)胞特異性抗體(如CD45)的磁珠消耗胰腺癌患者血樣中的白細(xì)胞，獲得未標(biāo)記的胰腺癌CTCs懸液。Zhang等[10]用抗CD45抗體消耗3.75ml血樣中的CD45+細(xì)胞，并通過結(jié)合CK、CD45、DAPI和CEP8鑒定胰腺癌患者CTCs。該方法不受腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性及EMT特性影響，能夠提高CTCs檢測(cè)率[11]。

2.基于分子法PCR的胰腺癌CTCs檢測(cè)：該方法將胰腺癌患者血樣中腫瘤特異性mRNA高水平表達(dá)作為CTCs的替代標(biāo)志物，通過將正常血樣作為對(duì)照設(shè)定閾值，以便定量檢測(cè)腫瘤特異性mRNA[12，13]。

Chausovsky等首次使用巢式實(shí)時(shí)定量PCR(nested RT-PCR)檢測(cè)胰腺癌患者血樣中CK20 mRNA的表達(dá)，79%(22/28)胰腺癌患者CK20擴(kuò)增，22例正常對(duì)照者CK20擴(kuò)增均為陰性。Zhou等[14]研究表明，多標(biāo)記比單標(biāo)記顯示出更好的結(jié)果，對(duì)25例初診胰腺癌患者進(jìn)行人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)、C-MET、CK20和CEA的RT-PCR，檢測(cè)陽性表達(dá)率分別為100%(25/25)、80%(20/25)、84%(21/25)和80%(20/25)。

基于PCR的胰腺癌CTCs檢測(cè)具有較高的敏感度，但是由于并缺乏胰腺癌特異性mRNA，常用上皮特異性mRNA替代，因此敏感度往往會(huì)伴隨著假陽性的出現(xiàn)。

二、胰腺癌CTCs體內(nèi)檢測(cè)

Lin的研究小組開發(fā)了一種用于CTCs檢測(cè)的體內(nèi)技術(shù)，稱為活體流式細(xì)胞術(shù)(IVFC)，它結(jié)合了傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微鏡檢測(cè)?；铙w檢測(cè)的方法包括活體熒光流式細(xì)胞術(shù)(FFC)和活體光聲流式細(xì)胞術(shù)(PAFC)：FFC的原理為當(dāng)帶有熒光標(biāo)記的CTCs流經(jīng)激光時(shí)，被激發(fā)的熒光被光電倍增管收集，產(chǎn)生不同于血液背景的信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)CTCs的活體檢測(cè)[15]。PAFC利用生物組織的光聲效應(yīng)，當(dāng)激光照射組織時(shí)，組織吸收光能量產(chǎn)生熱膨脹，向外輻射超聲波，通過分析超聲換能器接收的不同聲波信號(hào)來檢測(cè)CTCs[16]。

IVFC可用于研究活體循環(huán)系統(tǒng)中胰腺癌CTCs在特定時(shí)間區(qū)間內(nèi)的數(shù)量變化趨勢(shì)，為療效判斷和預(yù)后提供依據(jù)。目前實(shí)驗(yàn)研究多采用胰腺癌細(xì)胞體外標(biāo)記，注射入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)，或異種移植到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，對(duì)胰腺癌CTCs變化趨勢(shì)進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)。研究表明，CTC簇比單個(gè)CTC有更大的轉(zhuǎn)移潛能，IVFC檢測(cè)CTC簇的熒光信號(hào)顯示為多個(gè)峰，而單個(gè)CTC的熒光信號(hào)顯示為單峰，CTC簇的信號(hào)比單個(gè)CTC具有更長的持續(xù)時(shí)間[17]。IVFC可以實(shí)時(shí)、定量地對(duì)胰腺癌CTCs進(jìn)行活體檢測(cè)，相較于體外檢測(cè)方式，具有非侵入性、高敏感度和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的優(yōu)勢(shì)，可用于研究胰腺癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移的CTCs動(dòng)力學(xué)變化。

三、CTCs在胰腺癌診療中的應(yīng)用

1.診斷和分期：Xu等[11]通過陰性富集，免疫熒光8號(hào)染色體原位雜交(NE-iFISH)來捕獲和鑒定胰腺癌患者的CTCs，NE-iFISH系統(tǒng)在胰腺癌患者中表現(xiàn)出極高的CTCs檢出率(90%)，結(jié)合CTCs≥2和CA19-9>37μmol/L，PC的診斷率可達(dá)到97.5%。

Ankeny檢測(cè)了72例胰腺癌患者和28例其他胰腺疾病患者的CTCs，顯示Ⅰ～Ⅱ期患者CTCs陽性率為54.84%(17/31)、Ⅲ期陽性率為78.57%(11/14)、Ⅳ期陽性率為96.30%(26/27)；28例其他胰腺疾病患者中僅1例檢測(cè)出1個(gè)CTCs。統(tǒng)計(jì)表明可以將CTCs≥3個(gè)/4毫升作為Ⅳ期胰腺癌的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，CTCs有望成為胰腺癌診斷和分期的生物學(xué)標(biāo)志物。

2.療效和預(yù)后:Torphy等[18]建立胰腺導(dǎo)管腺癌小鼠模型，隨機(jī)分為兩組，分別使用化療藥物和空白載體治療28天，并于治療前后檢測(cè)CTCs，化療組CTCs計(jì)數(shù)治療后明顯減少(26.61個(gè)/250微升 vs 2.21個(gè)/250微升,P=0.021)，而空白組治療前后CTCs計(jì)數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(23.26個(gè)/250微升 vs 11.89個(gè)/250微升,P=0.808)。CTCs的連續(xù)監(jiān)測(cè)可以用作預(yù)測(cè)治療反應(yīng)的微創(chuàng)方法以指導(dǎo)治療方案。

楊陽[19]通過檢測(cè)48例胰腺癌患者術(shù)后外周血CTCs變化情況，探討高強(qiáng)度聚焦超聲消融(high-intensity focused ultrasound, HIFU)與開放手術(shù)兩種治療方法對(duì)胰腺癌細(xì)胞血行性播散的影響, 應(yīng)用免疫磁珠負(fù)性富集結(jié)合免疫熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)外周血CTCs。研究發(fā)現(xiàn)，開放手術(shù)和HIFU治療均有可能發(fā)生醫(yī)源性癌細(xì)胞血行播散，并且手術(shù)治療CTCs檢出率高于HIFU治療，因此胰腺癌患者接受開放手術(shù)或HIFU治療后，應(yīng)酌情給予化療、增強(qiáng)免疫力等輔助治療。

四、展 望

CTCs診斷胰腺癌的敏感度低于EUS-FNA，但特異性(100%)與組織病理活檢相當(dāng)，具有低風(fēng)險(xiǎn)、低成本、高特異性等優(yōu)點(diǎn)[20]。目前對(duì)胰腺癌CTCs的檢測(cè)尚未形成統(tǒng)一指南，檢測(cè)方法的差異使得研究之間的比較變得困難，并且在廣泛采用之前，必須嚴(yán)格驗(yàn)證“可重復(fù)性”。未來的發(fā)展中，實(shí)現(xiàn)胰腺癌CTCs檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化，需要更多獨(dú)立驗(yàn)證研究以及在大型前瞻性臨床試驗(yàn)中的嚴(yán)格評(píng)估。