陳敬騰 方 碩 郭衛(wèi)春

骨肉瘤是最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤之一，5年生存率僅60%～70%[1]。相比其他肉瘤，骨肉瘤對(duì)放射敏感度低，目前其主要的治療方式是手術(shù)切除輔以化療，但是伴有肺部轉(zhuǎn)移的患者5年生存率亦不足20%，亟需尋找新的治療方案[2]。近年來提倡以免疫療法、基因療法及靶向治療與化療結(jié)合的綜合性治療方案，而骨肉瘤基因存在著復(fù)雜的基因重組及拷貝基因變異，對(duì)其進(jìn)行基因靶向治療仍然是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)[3,4]。

Hippo是一種進(jìn)化上高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過控制細(xì)胞增殖和凋亡起到調(diào)節(jié)器官大小和維持組織穩(wěn)態(tài)的作用[5]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，Hippo信號(hào)通路可調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性行為[6]。但關(guān)于Hippo信號(hào)通路在骨肉瘤中的研究較少，分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本文綜述了Hippo信號(hào)通路的組成、調(diào)節(jié)機(jī)制及骨肉瘤中Hippo信號(hào)通路分子變異情況，以期為骨肉瘤研究和防治提供更廣闊的思路。

一、Hippo信號(hào)通路的概述

對(duì)Hippo信號(hào)通路的描述始于2003年果蠅hippo基因的發(fā)現(xiàn)， Pan和Hariharan實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)Hippo功能失活負(fù)性調(diào)控組織生長。隨后，研究揭示Hippo信號(hào)通路是一種進(jìn)化上高度保守的級(jí)聯(lián)，由接頭蛋白和調(diào)控Yorkie(促生長轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子)的抑制性激酶組成[7]。哺乳動(dòng)物中，Hippo信號(hào)通路將來自質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)的信號(hào)傳遞到細(xì)胞核中，在核內(nèi)調(diào)節(jié)多組不同靶基因的表達(dá)，從而控制細(xì)胞增殖、分化和凋亡。典型的Hippo信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括哺乳動(dòng)物STE20樣蛋白激酶1/2 (mammalian STE20-like protein kinase 1/2 ，MST1/2, 為果蠅Hippo同源物)、大腫瘤抑制基因1/2(large tumor suppressor 1/2，Lats1/2)，接頭蛋白Salvador同源物1(Salvador homolog 1 ，SAV1)、Mob激酶活化劑1(Mob kinase activator 1 ，MOB1)、Yes-相關(guān)蛋白1(Yes-associated protein 1，YAP，為Yorkie同源物)和具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子(transcriptional co-activator with PDZ binding motif ，TAZ，也稱為含WW結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1，WW domain-containing transcription regulator 1, WWTR1)[7, 8]。Hippo信號(hào)通路打開時(shí)， MST1/2 激酶發(fā)生磷酸化以激活Lats1/2 激酶，活化的Lats1/2在Sav1 的輔助下激活MOB1，繼而Lats1/2的PPxY(PY)基序與YAP/TAZ的WW結(jié)構(gòu)域之間相互作用使YAP/TAZ磷酸化，磷酸化的YAP /TAZ 與14-3-3 結(jié)合后滯留在細(xì)胞質(zhì)中，被β-含有E3泛素轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)蛋白連接酶(β-transducin repeat containing E3 ubiquitin protein ligase，β-TRCP)依賴性蛋白酶體降解，失去轉(zhuǎn)錄共激活作用。當(dāng)Hippo信號(hào)通路關(guān)閉時(shí)，YAP/TAZ轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與TEA-含有特異性序列轉(zhuǎn)錄因子(TEA domain-containing sequence-specific transcription factors，TEADs)以及其他轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，激活下游靶基因，促進(jìn)腫瘤形成[8, 9]。

二、Hippo信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制

筆者對(duì)Hippo信號(hào)通路的理解大部分來自于在上皮組織中進(jìn)行的研究， 其中YAP/TAZ的轉(zhuǎn)錄活性受4個(gè)相互關(guān)聯(lián)的信號(hào)調(diào)節(jié)：①質(zhì)膜蛋白，它可以直接與YAP/TAZ直接復(fù)合，從而在細(xì)胞-細(xì)胞連接處阻斷質(zhì)膜信號(hào)；②上游接頭蛋白，它可以激活Hippo核心激酶，最終磷酸化YAP/TAZ以抑制其活性；③其他信號(hào)通路的交叉串?dāng)_調(diào)節(jié)；④作用于細(xì)胞的機(jī)械力，它可以局部控制YAP/TAZ定位。

1.質(zhì)膜蛋白：當(dāng)細(xì)胞密度增加到一定程度時(shí)，生長調(diào)控信號(hào)通過質(zhì)膜蛋白傳遞到上游Hippo蛋白，進(jìn)而啟動(dòng)下游一系列細(xì)胞因子表達(dá)以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。目前，研究較多的質(zhì)膜蛋白有Crumbs極性復(fù)合物、G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptor, GPCR)、CD44以及非典型鈣黏蛋白Fat。Crumbs極性復(fù)合物是一種跨膜蛋白，招募位于頂端區(qū)域的支架蛋白介導(dǎo)細(xì)胞極性，它與其他極性蛋白質(zhì)和黏附蛋白之間即相互作用，又為Hippo組件提供上游信號(hào)輸入因子[10]。GPCR被認(rèn)為是一種調(diào)節(jié)Hippo信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的質(zhì)膜蛋白，YAP/TAZ 受到眾多分泌信號(hào)和相關(guān)GPCR 的調(diào)控，從而將Hippo 信號(hào)通路與更多胞外信號(hào)聯(lián)系起來，發(fā)揮更多的生理功能[11]?？缒ね该髻|(zhì)酸受體CD44在Hippo通路中起到重要作用，它與神經(jīng)纖維蛋白2(neurofibromin2，NF2，也稱為Merlin)和其他支架蛋白相互作用，募集Lats到細(xì)胞膜并在那里磷酸化[12]。非典型鈣黏蛋白Fat能促進(jìn)FRMD6擴(kuò)增并定位到頂端連接，導(dǎo)致MST1/2的激活[13]。

2.上游接頭蛋白：Hippo通路的核心元件受上游復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制。MST和Lats激酶的活性受多種上游蛋白調(diào)節(jié)，包括含Ras-相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族蛋白(Ras-association domain containing family proteins，RASSFs1-10)，腎和腦蛋白(kidney and brain protein，KIBRA)，一千零一個(gè)氨基酸蛋白1(thousand and one amino acid protein 1，TAO-1)，MAP/微管親和調(diào)節(jié)激酶1(microtubule affinity-regulating kinase 1， MARK1)和NF2[14]。RASSFs和SAV1通過與SARAH(SAlvador-RAssf-Hpo)結(jié)合域相互作用調(diào)節(jié)MST活性，之后MST1/2與SAV1形成復(fù)合物以磷酸化Lats1/2；MAT1/2-SAV1復(fù)合物也可以結(jié)合MOB1使MOB1磷酸化，磷酸化的MOB1結(jié)合Lats1/2使其發(fā)生自我磷酸化[15]。目前已經(jīng)有越來越多的研究來探討上游蛋白和Hippo激酶之間的相互作用，但它們結(jié)合到何種程度還取決于組織類型、細(xì)胞環(huán)境以及它們對(duì)典型Hippo信號(hào)通路的依賴性，這仍需要進(jìn)一步的研究。

Hippo信號(hào)通路在細(xì)胞接觸抑制、細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡中起重要作用。隨著細(xì)胞匯合增加，腫瘤抑制因子NF2定位在細(xì)胞連接處的附近以激活Hippo信號(hào)，研究表明抑制YAP可以抑制間皮瘤和腦膜瘤中NF2失活引起癌細(xì)胞的過度增殖；另外，敲除肝臟特異性NF2的小鼠中過表達(dá)顯示陰性的TEAD能夠抑制腫瘤生長[16]。YAP/TAZ和Lats2之間存在著負(fù)反饋回路，YAP/TAZ和TEAD復(fù)合后通過NF2誘導(dǎo)Lats2表達(dá)，同時(shí)Lats2可以通過AMOT磷酸化抑制YAP/TAZ活性。另外，YAP和TAZ之間也可能存在著負(fù)性調(diào)節(jié)，有研究表明，YAP敲除的小鼠中TAZ富集，而體外抑制或過表達(dá)YAP會(huì)導(dǎo)致TAZ蛋白表達(dá)的反向變化[17]。

3.信號(hào)通路間的交叉串?dāng)_:細(xì)胞、器官、組織的狀態(tài)和功能由一個(gè)多信號(hào)通路組成的形態(tài)發(fā)生信號(hào)整合網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，有研究者發(fā)現(xiàn)Hippo轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是這個(gè)整合網(wǎng)絡(luò)的樞紐[9]。雖然肉瘤中通路間交叉串?dāng)_仍需要進(jìn)一步探討，但是已有研究證明這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中許多通路可以單獨(dú)引起肉瘤發(fā)生。YAP/TAZ已經(jīng)被公認(rèn)為是眾多信號(hào)級(jí)聯(lián)的共轉(zhuǎn)錄激活因子。然而，目前人們對(duì)交叉串?dāng)_調(diào)節(jié)方式的認(rèn)識(shí)還處于初步階段，Hippo信號(hào)通路與其他通路間是通過協(xié)同作用還是拮抗作用來調(diào)節(jié)生物活動(dòng)的還需要進(jìn)一步研究。

Wnt通路與Hippo通路之間存在著相互作用以調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。Rosenbluh等在85個(gè)癌細(xì)胞系(包括骨肉瘤)中進(jìn)行全基因組規(guī)模的功能喪失篩選，發(fā)現(xiàn)腫瘤Wnt活化依賴于β-catenin和轉(zhuǎn)錄因子TBX5。β-catenin來源的原位結(jié)腸癌小鼠模型中β-catenin與YAP形成復(fù)合物參與腫瘤形成[18]。Heallen等[19]發(fā)現(xiàn)敲除小鼠心肌細(xì)胞Hippo組件中的Sav1，MST1/2或Lats2后YAP活性增加，且心肌細(xì)胞增殖增強(qiáng)。對(duì)這些小鼠進(jìn)行基因譜分析發(fā)現(xiàn)Wnt活性增強(qiáng)，而條件性缺失β-catenin一條等位基因后心肌細(xì)胞功能受到抑制,證實(shí)了Wnt與Hippo通路間的相互作用。TGF-β和Hippo信號(hào)通過協(xié)同作用指導(dǎo)細(xì)胞行為。YAP/TAZ與SMADs相互作用以促進(jìn)TGF-β和BMP靶基因的轉(zhuǎn)錄，TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以調(diào)節(jié)YAP/TAZ表達(dá)以驅(qū)動(dòng)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)分化[20]。Hong等用BMP2處理MSC，發(fā)現(xiàn) TAZ表達(dá)增加，其與Runx2的相互作用也增強(qiáng)以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。Notch與Hippo信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)間的也存在著協(xié)同作用的“交叉串?dāng)_”。Notch已被證明是骨和軟組織肉瘤的驅(qū)動(dòng)因素[21]。在YAP/TAZ機(jī)械依賴性調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)镹otch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)的過程中，YAP/TAZ將來自細(xì)胞外基質(zhì)的物理刺激轉(zhuǎn)化為細(xì)胞-細(xì)胞間信號(hào)級(jí)聯(lián)，繼而控制細(xì)胞增殖、凋亡、分化等[22]。綜上，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)和惡性腫瘤方面，這些見解為研究Hippo信號(hào)通路提供了更深入的認(rèn)識(shí)。

4.機(jī)械力因素:細(xì)胞在發(fā)揮維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)器官發(fā)育的功能時(shí)，必須及時(shí)感知微環(huán)境變化且對(duì)變化做出相應(yīng)改變，除了傳輸生物化學(xué)信號(hào)外，細(xì)胞還可以從機(jī)械力信號(hào)中提取信息。在細(xì)胞水平，機(jī)械力轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過感知物理刺激(細(xì)胞外基質(zhì)的彈力和細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-基質(zhì)相互作用產(chǎn)生的力)將其轉(zhuǎn)化為生物信號(hào)，細(xì)胞通過快速支架重塑來適應(yīng)這種物理刺激，將支架重塑與細(xì)胞生物行為變化聯(lián)系起來的動(dòng)態(tài)因子即YAP和TAZ[23]。因此，機(jī)械力刺激可以通過調(diào)節(jié)YAP/TAZ活性調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)，并決定干細(xì)胞維持、增殖和分化。

在高機(jī)械應(yīng)力和低細(xì)胞接觸的情況下，YAP/TAZ轉(zhuǎn)錄活躍，而致細(xì)胞增殖及組織生長；隨著細(xì)胞接觸增加，黏附分子激活Lats，導(dǎo)致YAP/TAZ磷酸化而無法進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用[9]。F-肌動(dòng)蛋白聚合和應(yīng)力纖維形成均可使YAP/TAZ定位于核內(nèi)而活化，而破壞F-肌動(dòng)蛋白則抑制YAP/TAZ轉(zhuǎn)錄活性。細(xì)胞外基質(zhì)硬度以及細(xì)胞形狀可以控制Rho-GTP酶的活性及應(yīng)力纖維和肌動(dòng)蛋白束的形成來調(diào)節(jié)YAP/TAZ定位；而當(dāng)培養(yǎng)于高硬度細(xì)胞外基質(zhì)或被制成“伸展”形態(tài)時(shí)，YAP和TAZ在核內(nèi)活化且MSC分化成成骨細(xì)胞[24]?？梢奩AP和TAZ充當(dāng)這機(jī)械力轉(zhuǎn)導(dǎo)的感受器和細(xì)胞對(duì)機(jī)械信號(hào)響應(yīng)的介質(zhì)，YAP/TAZ的這種機(jī)械力因素取代了來自細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-基質(zhì)的接觸因素。

三、骨肉瘤Hippo信號(hào)通路變異

1.YAP:人類組織芯片分析證實(shí)骨肉瘤中YAP1表達(dá)量高于周圍非腫瘤組織，并且表達(dá)量與腫瘤級(jí)別相關(guān)，78%的人類骨肉瘤樣本中YAP1高表達(dá)，同時(shí)靶基因表達(dá)量也增多[25]。體外實(shí)驗(yàn)中，抑制YAP表達(dá)后細(xì)胞增殖及細(xì)胞侵襲能力降低，Runx3、CyclinD1和MMP-9的表達(dá)量也降低；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，抑制小鼠異種移植骨肉瘤或轉(zhuǎn)基因小鼠成瘤模型的YAP活性后腫瘤生長被抑制[26]。

骨肉瘤中YAP上調(diào)的機(jī)制復(fù)雜，其中干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Sox2起著重要作用。在小鼠骨肉瘤細(xì)胞系中，Sox2直接抑制Hippo通路激活劑NF2和Kibra,導(dǎo)致YAP高表達(dá)，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)成為干細(xì)胞富集的骨肉瘤球后，YAP表達(dá)量則更高(而NF2表達(dá)量更低)。在敲除Sox2基因的細(xì)胞中，無論是Yap過度表達(dá)還是NF2抑制都能促使骨肉瘤球形成；而抑制YAP或者高表達(dá)NF2卻促進(jìn)成骨分化并抑制骨肉瘤球形成。過表達(dá)野生型YAP或活化重組突變型YAP能夠抑制NF2誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞分化表型，而缺乏TEAD結(jié)合位點(diǎn)的突變型YAP沒有此作用。Sox2通過經(jīng)典Hippo信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)YAP活性，抑制MST1/2或Lats1/2消除了NF2誘導(dǎo)的成骨分化作用，YAP的表達(dá)和功能也發(fā)生變化[27]。

YAP上調(diào)也可受Hedgehog通路調(diào)節(jié)。Ptch1c/+、p53+/-、HOC-Cre突變小鼠中惡性骨肉瘤具有高外顯率，在p53雜合背景下Hedgehog信號(hào)部分上調(diào)，并且所得腫瘤中YAP1高表達(dá)，而在抑制Hedgehog信號(hào)后YAP1表達(dá)又顯著降低，YAP1所引起的腫瘤進(jìn)展也被抑制。Chan等[28]也表明Hh-YAP軸可能通過調(diào)節(jié)LncRNA-H19的表達(dá)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

2.RASSFs：現(xiàn)已證明RASSF5與RASSF10是骨肉瘤的腫瘤抑制因子，類似于RASSF家族中其他成員，在人類腫瘤(包括骨肉瘤)CpG島啟動(dòng)子超甲基化作用下RASSF5和RASSF10下調(diào)。在一份載有45例骨肉瘤樣本的組織芯片數(shù)據(jù)中，RASSF5顯著下調(diào)，其表達(dá)量與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)中，抑制U2OS細(xì)胞RASSF5表達(dá)，則MST1促凋亡功能失活，從而抵抗TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；相反地，高表達(dá)骨肉瘤細(xì)胞系中的RASSF5，細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力減弱，而細(xì)胞凋亡增強(qiáng)[29]。

3.NF2：人類生殖細(xì)胞或體細(xì)胞中NF2的一個(gè)等位基因突變將會(huì)導(dǎo)致2型神經(jīng)纖維瘤病發(fā)生，該突變與神經(jīng)鞘瘤，腦膜瘤和室管膜瘤也有相關(guān)性。NF2雜合的小鼠具有高致瘤率，能導(dǎo)致多種惡性腫瘤發(fā)生，其中骨肉瘤發(fā)生率為63%。而在這些腫瘤體細(xì)胞內(nèi)野生型NF2等位基因均存在突變，也就意味著NF2雜合性的喪失可能導(dǎo)致肉瘤生成。

4.CD44：CD44是一種細(xì)胞表面糖蛋白，可將細(xì)胞外信號(hào)傳遞給ERK，AKT和Hippo通路。研究發(fā)現(xiàn)，異種移植小鼠中降低CD44表達(dá)可以觀察到骨肉瘤惡性表型增強(qiáng)，但在體外實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)CD44被NF2抑制后會(huì)導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞系遷移和侵襲能力減弱。Hartmann等表明NF2與CD44復(fù)合后通過ECM信號(hào)介導(dǎo)接觸生長抑制。

5.MOB1：在體外實(shí)驗(yàn)中，MOB1A高表達(dá)會(huì)降低細(xì)胞增殖能力，而抑制MOB1A表達(dá)將導(dǎo)致異常有絲分裂。在缺失MOB1A和MOB1B的雙突變小鼠中，兩個(gè)等位基因完全喪失(MOB1AΔ/Δ1Btr/tr，MOB1A無效突變，MOB1B基因陷阱)會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡。然而，保留任一個(gè)等位基因(MOB1AΔ/ +1Btr /tr或MOB1AΔ/Δ1Btr/ +)的雙突變小鼠可在70周內(nèi)存活，并且100%能自發(fā)形成腫瘤。24%的小鼠(9/37)出現(xiàn)骨外骨肉瘤，而92%小鼠(34/37)出現(xiàn)良性外生骨疣。檢測(cè)單個(gè)雜合子(MOB1AΔ/ +1Btr /tr或MOB1AΔ/Δ1Btr/ +)組中，發(fā)現(xiàn)所有腫瘤都顯示野生型MOB1等位基因缺失，表明雜合性缺失可能是腫瘤生長所必需的。

四、展 望

Hippo信號(hào)通路是一種進(jìn)化上保守的腫瘤抑制網(wǎng)絡(luò)，不僅對(duì)正常的細(xì)胞、組織和器官的發(fā)育，體內(nèi)平衡和修復(fù)有重要作用，在許多癌癥中也發(fā)現(xiàn)它調(diào)控異常。目前，上游核心Hippo通路成員、接頭蛋白的遺傳和表觀遺傳失調(diào)已經(jīng)被注意到，Hippo信號(hào)在正常和癌性間充質(zhì)細(xì)胞行為和命運(yùn)的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用提供了對(duì)肉瘤生物學(xué)的更多見解。Hippo通路中單個(gè)基因的突變會(huì)造成通路調(diào)節(jié)的失調(diào)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，但其在骨肉瘤中發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步的研究來闡明特定肉瘤亞型中Hippo途徑失調(diào)的潛在機(jī)制，為成功開發(fā)治療干預(yù)骨肉瘤提供基礎(chǔ)。