鄭 彬，劉 燕，張彩瑩，史利娟，劉 鉞，李 勇

（1.南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南南陽(yáng)473000； 2.河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司，河南南陽(yáng)473000）

酒精發(fā)酵原料來(lái)源廣泛，既可以采用玉米、小麥、木薯等淀粉質(zhì)原料，甘蔗、糖蜜等糖質(zhì)原料，也可以使用木質(zhì)纖維素等纖維質(zhì)原料。受各種因素的影響，用于發(fā)酵酒精的淀粉質(zhì)原料主要是玉米和木薯，但由于玉米細(xì)胞壁含有部分非淀粉多糖，如纖維素、非纖維素多糖（戊聚糖、β-葡聚糖等），果膠多糖等；而木薯淀粉大部分是支鏈淀粉，含直鏈淀粉較少，這些因素的存在一定程度上會(huì)影響淀粉充分水解，不利于原料的高效利用[1-2]。

酸性蛋白酶可以分解淀粉質(zhì)原料中的蛋白質(zhì)為氨基酸，為酵母生長(zhǎng)提供必需的氮源，既保證了酵母的生長(zhǎng)，又可以使蛋白包裹的淀粉更易于水解，還不必消耗糖分轉(zhuǎn)化氨基酸[3]。木聚糖酶可以分解谷物原料細(xì)胞壁中的木聚糖，破壞原料細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促進(jìn)淀粉、蛋白質(zhì)等有效成分的溶出，加速糖化酶等酶的作用[4]。普魯蘭酶是一種淀粉脫支酶，能夠快速使α-1,6糖苷鍵水解，專一性切開支鏈淀粉分支點(diǎn)，切下整個(gè)分支結(jié)構(gòu)，形成直鏈淀粉，便于糖化酶糖化[5]。大量研究表明，在玉米、木薯等淀粉質(zhì)原料中添加酸性蛋白酶、木聚糖酶、普魯蘭酶等專用酶制劑，可以提高淀粉利用率[6-8]?，F(xiàn)在也有研究人員探索使用復(fù)合酶制劑對(duì)單一淀粉原料開展相關(guān)酒精發(fā)酵研究[9-10]。

本研究在前期不同酶制劑對(duì)單一淀粉質(zhì)原料酒精發(fā)酵影響試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)玉米酒精發(fā)酵有明顯促進(jìn)作用的酸性蛋白酶、木聚糖酶、普魯蘭酶，對(duì)木薯酒精發(fā)酵有明顯促進(jìn)作用的普魯蘭酶、酸性蛋白酶開展玉米、木薯混合原料酒精發(fā)酵研究，以期對(duì)玉米、木薯混合原料酒精生產(chǎn)添加酶制劑提供參考，以提高原料利用率，增加企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

菌種：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）ZU108，本實(shí)驗(yàn)室保存。

原料：木薯粉，粉碎粒度為0.25 mm；玉米粉，粉碎粒度為0.50 mm。均取自天冠集團(tuán)燃料乙醇公司粉碎車間。

酶制劑：液化酶(30000 U/mL)，糖化酶(100000 U/mL)，酸性蛋白酶(100000 U/mL)，普魯蘭酶（2000 U/mL），木聚糖酶(70000 U/mL)，均取自天冠集團(tuán)燃料乙醇公司乙醇廠。

試劑：葡萄糖、硫酸銅、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉，均為市售分析純。

儀器設(shè)備：DK-S28電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ZHWY-211C恒溫培養(yǎng)振蕩箱，上海智城分析儀器制造有限公司；XSP-6C生物顯微鏡，上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司；DL-1萬(wàn)用電爐，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SW-C-1C超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；PL-403電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酒精發(fā)酵試驗(yàn)

按試驗(yàn)方案，稱取原料（玉米粉∶木薯粉=8∶2），料水比1∶2.1，并用自來(lái)水調(diào)漿，攪拌均勻后用10%的硫酸或10%的氫氧化鈉調(diào)整pH值至5.4～5.6，繼續(xù)攪勻，按15 U/g原料的比例加入液化酶，然后置于98℃恒溫水浴鍋內(nèi)液化2 h，取出冷卻至室溫后補(bǔ)水至原質(zhì)量。加入糖化酶，添加量為160 U/g原料；按試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加入不同的酶制劑，接種后于33℃進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 檢測(cè)方法

酒精度的測(cè)定：蒸餾-密度計(jì)法[11-12]?？偺堑臏y(cè)定：斐林試劑滴定法[11-12]。外觀糖度的測(cè)定：密度計(jì)法[11-12]。酸度的測(cè)定：氫氧化鈉滴定法[11-12]。還原糖的測(cè)定：斐林試劑滴定法[11-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性蛋白酶添加量對(duì)酒精發(fā)酵的影響

酸性蛋白酶在接種時(shí)添加，開展不同添加量的酒精發(fā)酵試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 酸性蛋白酶不同添加量酒精發(fā)酵結(jié)果

由表1可看出，隨著酸性蛋白酶添加量的增加，不同發(fā)酵時(shí)段CO2失重均有明顯提高，殘還原糖、殘總糖均有明顯下降，酒精度顯著提高。當(dāng)酸性蛋白酶的添加量小于12 U/g原料時(shí)，隨添加量的增加，殘還原糖、殘總糖逐漸降低，酒精度逐漸上升。當(dāng)添加量達(dá)到12 U/g原料時(shí)，殘還原糖、殘總糖均達(dá)到最低值，分別為0.22%、1.92%，酒精度達(dá)到最高值14.26%vol。此后再增加酶的用量，各項(xiàng)指標(biāo)基本不變。試驗(yàn)結(jié)果表明，添加酸性蛋白酶后，不僅CO2失重總量增加，而且可加快發(fā)酵速率，提高酒精度，酸性蛋白酶的適宜添加量為12 U/g原料。

2.2 普魯蘭酶添加量對(duì)酒精發(fā)酵的影響

普魯蘭酶在接種時(shí)添加，開展不同添加量的酒精發(fā)酵試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可看出，隨著普魯蘭酶添加量的增加，不同發(fā)酵時(shí)段CO2失重均有提高，殘還原糖、殘總糖有明顯下降。當(dāng)普魯蘭酶的添加量小于15 U/g原料時(shí)，隨添加量的增加，殘還原糖、殘總糖逐漸降低，酒精度逐漸上升。當(dāng)添加量達(dá)到15 U/g原料時(shí)，殘還原糖、殘總糖達(dá)到最低值，分別為0.24%、2.07%，酒精度達(dá)到最高值14.15%vol。此后再增加酶的用量，各項(xiàng)指標(biāo)基本不變。試驗(yàn)結(jié)果表明，添加普魯蘭酶后，CO2失重總量增加，發(fā)酵速率明顯加快，酒精度顯著提高，普魯蘭酶的適宜添加量為15 U/g原料。

表2 普魯蘭酶不同添加量酒精發(fā)酵結(jié)果

2.3 木聚糖酶添加量對(duì)酒精發(fā)酵的影響

木聚糖酶在接種時(shí)添加，開展不同添加量的酒精發(fā)酵試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可看出，隨著木聚糖酶添加量的增加，不同發(fā)酵時(shí)段CO2失重均有提高，殘還原糖、殘總糖有明顯下降。當(dāng)木聚糖酶的添加量小于150 U/g原料時(shí)，隨著添加量的增加，殘還原糖、殘總糖逐漸降低，酒精度逐漸上升。當(dāng)添加量達(dá)到150 U/g原料時(shí)，殘還原糖、殘總糖達(dá)到最低值，分別為0.45%、2.42%，酒精度達(dá)到最高值14.20%vol。此后再增加酶的用量，各項(xiàng)指標(biāo)基本不變。試驗(yàn)結(jié)果表明，添加木聚糖酶后，CO2失重總量增加，發(fā)酵速率加快，酒精度有明顯提高，木聚糖酶的適宜添加量為150 U/g原料。

表3 木聚糖酶不同添加量酒精發(fā)酵結(jié)果

2.4 復(fù)合酶制劑在玉米、木薯混合原料酒精發(fā)酵中的條件優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇酸性蛋白酶、普魯蘭酶、木聚糖酶為影響因素，以成熟醪酒精度為響應(yīng)值設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平見表4，正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析見表5及表6。

由表5可知，不同酶制劑對(duì)玉米、木薯混合原料酒精發(fā)酵的影響程度為A＞C＞B，即酸性蛋白酶＞木聚糖酶＞普魯蘭酶，最優(yōu)組合為A3C3B3，即酸性蛋白酶16 U/g原料、木聚糖酶170 U/g原料、普魯蘭酶20 U/g原料。在此優(yōu)化條件下開展3批次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，發(fā)酵醪酒精度為14.65%vol。

由表6可知，酸性蛋白酶對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響極顯著，木聚糖酶、普魯蘭酶對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響顯著。

表4 正交試驗(yàn)因素水平表

表5 酶制劑正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.5 復(fù)合酶制劑對(duì)酒精發(fā)酵的影響

2.5.1 復(fù)合酶制劑對(duì)拌料濃度的影響

按不同料水比配料后進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，復(fù)合酶制劑在接種時(shí)添加，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 添加復(fù)合酶制劑后拌料濃度對(duì)淀粉利用率的影響

由圖1可以看出，隨著拌料濃度提高，淀粉利用率先升后降，在相同料水比條件下，添加復(fù)合酶制劑后淀粉利用率明顯比對(duì)照樣高。結(jié)果表明，添加復(fù)合酶制劑不僅可以提高淀粉利用率而且原料拌料濃度可以適度增加，添加復(fù)合酶制劑后，料水比為1:2.1較適宜。

2.5.2 復(fù)合酶制劑對(duì)添加時(shí)間的影響

按料水比1∶2.1配料，復(fù)合酶制劑分別在液化后冷卻至50℃時(shí)添加（作用1 h）、接種時(shí)添加、接種后4 h時(shí)添加、接種后8 h時(shí)添加，開展酒精發(fā)酵試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表7。

由表7可看出，復(fù)合酶在液化后冷卻至50℃時(shí)添加，盡管此時(shí)的溫度與復(fù)合酶制劑的最適作用溫度接近，但易染菌，酸度較高，酒精度偏低。復(fù)合酶分別在接種后4 h、8 h進(jìn)行添加，酸度略高，酒精度較高，但也存在染菌風(fēng)險(xiǎn)，并且酶制劑需要一定的作用時(shí)間才能代謝分解相應(yīng)的底物，不能使氨基酸等物質(zhì)盡快被酵母利用，發(fā)酵效果略差。接種時(shí)添加復(fù)合酶，既避免了多次操作增加染菌風(fēng)險(xiǎn)，又可以保證酶制劑的作用時(shí)間，發(fā)酵終止時(shí)的酸度、殘總糖均較低，酒精度最高。試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合酶制劑最佳添加時(shí)間為接種時(shí)添加。

表7 復(fù)合酶制劑不同添加時(shí)間對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

2.5.3 復(fù)合酶制劑對(duì)酵母數(shù)量及醪液過(guò)濾速度的影響

按料水比1∶2.1配料，復(fù)合酶制劑在接種時(shí)添加開展酒精發(fā)酵試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表8。

表8 復(fù)合酶制劑對(duì)酵母菌數(shù)量及醪液過(guò)濾速度的影響

由表8可以看出，不同發(fā)酵時(shí)間，添加組酵母菌的數(shù)量均明顯高于對(duì)照組，分析可能是添加的酸性蛋白酶為酵母菌提供了更多氮源，加快其生長(zhǎng)速度；添加組的醪液過(guò)濾速度比對(duì)照組略快，分析可能是木聚糖酶將高分子木聚糖分解成小分子木糖，醪液黏稠度降低，促進(jìn)過(guò)濾速度加快。試驗(yàn)結(jié)果表明，添加復(fù)合酶制劑可以提高酵母菌數(shù)量及醪液過(guò)濾速度。

2.5.4 復(fù)合酶制劑對(duì)發(fā)酵周期的影響

按料水比1∶2.1，接種時(shí)添加復(fù)合酶制劑，開展酒精發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見表9。

表9 復(fù)合酶制劑對(duì)發(fā)酵周期的影響

由表9可以看出，不同發(fā)酵周期時(shí)間，添加組的殘總糖較對(duì)照組有明顯下降，酒精度比對(duì)照組有明顯提高。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，添加組殘總糖呈先下降后上升趨勢(shì)，酒精度表現(xiàn)出先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到56 h時(shí)，殘總糖達(dá)到最低值2.00%，酒精度達(dá)到最高值14.55%vol，再延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，殘總糖及酒精度基本不變。試驗(yàn)結(jié)果表明，添加復(fù)合酶制劑后酒精發(fā)酵在56 h時(shí)基本結(jié)束，可以縮短發(fā)酵時(shí)間12 h。

2.5.5 復(fù)合酶制劑對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值的影響

按料水比1∶2.1，接種時(shí)添加復(fù)合酶制劑，發(fā)酵時(shí)間56 h，開展發(fā)酵培養(yǎng)基不同pH值時(shí)酒精發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見表10。

表10 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對(duì)發(fā)酵的影響

由表10可以看出，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基pH值的升高，呈現(xiàn)出殘總糖先降低后升高，酒精度先升高后降低趨勢(shì)，當(dāng)pH5.0時(shí)，殘總糖最低為1.95%，酒精度最高為14.55%vol。試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基適宜的初始pH值為5.0。

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了酸性蛋白酶、普魯蘭酶、木聚糖酶對(duì)玉米、木薯混合原料酒精發(fā)酵的影響，正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，最適添加量為酸性蛋白酶16 U/g原料、木聚糖酶170 U/g原料、普魯蘭酶20 U/g原料。

3.2 通過(guò)考察復(fù)合酶制劑對(duì)混合原料酒精發(fā)酵的影響，確定最優(yōu)發(fā)酵條件：料水比為1∶2.1，復(fù)合酶制劑在接種時(shí)添加，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為5.0，發(fā)酵時(shí)間為56 h。

3.3 采用玉米、木薯混合原料酒精發(fā)酵時(shí)，添加復(fù)合酶制劑可以增加酵母菌數(shù)量，提高拌料濃度，加快醪液過(guò)濾速度，縮短發(fā)酵周期，最終提高原料淀粉利用率，獲得更高經(jīng)濟(jì)效益。