張 銳，王永祥，杜怡峰※

(1.聊城市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 聊城 252000； 2.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，濟(jì)南 250021)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種與人類年齡有關(guān)的進(jìn)行性退行性疾病，其典型臨床特征主要包括意識(shí)障礙、認(rèn)知功能障礙、記憶力下降、生活能力下降直至活動(dòng)能力喪失。截至目前，全球有3 000余萬AD患者，且大多數(shù)患者是散發(fā)的，只有5%的患者早期發(fā)病與遺傳因素有關(guān)[1]。世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)，到2050年AD患者將達(dá)1.15億人。曾新穎等[2]在1990—2016年中國及省級(jí)行政區(qū)疾病負(fù)擔(dān)報(bào)告中指出：2005—2016年我國AD增幅為57.8%。因?yàn)锳D病因復(fù)雜，起病隱匿，往往不能被及時(shí)發(fā)現(xiàn)，同時(shí)針對(duì)AD治療的藥物研究均以失敗告終。2019年初，Biogen和Eisai兩家制藥公司又宣布停止AD藥物研究的ENGAGE和EMERGE Ⅲ期臨床試驗(yàn)。所以目前缺乏治療AD的積極有效措施，這不僅增加了社會(huì)和家庭的壓力，也使其成為不可忽視的重大疾病。外泌體是1983年科學(xué)家在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)的，其最初被認(rèn)為是細(xì)胞處理不需要物質(zhì)的一種細(xì)胞機(jī)制[3]，到1987年外泌體才有了比較明確的定義。研究證實(shí)，特殊分泌囊泡——外泌體不但可以參加組織與細(xì)胞之間的通信，而且能廣泛參與生理進(jìn)程和病理的傳播，因此備受重視[4]。現(xiàn)就外泌體在AD發(fā)病機(jī)制和診療中的作用予以綜述。

1 外泌體概述及其生物學(xué)特性

外泌體實(shí)質(zhì)上屬于一種胞外囊泡，其直徑為40～200 nm，由核內(nèi)體通過逆行出芽的方式內(nèi)陷形成，隨之出現(xiàn)多囊泡體，多囊泡體內(nèi)含有大量腔內(nèi)囊泡。多囊泡體不僅可以和胞膜融合將其中的腔內(nèi)囊泡釋放到細(xì)胞外環(huán)境，還能結(jié)合溶酶體來降解其內(nèi)容物，或繼續(xù)留在細(xì)胞內(nèi)，形成Weibel- Palade小體、黑色素小體等特殊的細(xì)胞器。內(nèi)源性蛋白質(zhì)被分揀進(jìn)入腔內(nèi)囊泡的機(jī)制有兩種，即內(nèi)涵體分選復(fù)合物依賴型和非依賴型。其中，細(xì)胞因子(內(nèi)涵體分選復(fù)合物)的組件腫瘤易感基因101和ALG- 2相互作用蛋白X、鞘脂神經(jīng)酰胺在蛋白質(zhì)的分選過程中均起控制作用。此外，在缺乏內(nèi)涵體分選復(fù)合物時(shí)也有生成腔內(nèi)囊泡的情況，所以推斷目前還有不清楚的產(chǎn)生腔內(nèi)囊泡方式存在[5]。

外泌體存在于各種體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液、母乳等，并攜帶有不同的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA、微RNAs(microRNAs，miRNAs)、信使RNA、長鏈非編碼RNA及某些病毒來源的遺傳物質(zhì)[6]。在人體多種病理生理?xiàng)l件下的外泌體亞群均已確定[7- 8]，其攜帶的獨(dú)特生物學(xué)內(nèi)容物可以代表原始細(xì)胞源的生理和病理狀態(tài)。在神經(jīng)系統(tǒng)里，神經(jīng)干細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元均能分泌外泌體，且在腦脊液中已發(fā)現(xiàn)上述來源的外泌體[9]。

外泌體作為神經(jīng)細(xì)胞通信的信使，不僅能在一定程度上支持神經(jīng)細(xì)胞，還能為神經(jīng)細(xì)胞生理功能穩(wěn)定提供保障，同時(shí)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)平衡發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[10]。其作用方式包括直接作用于受體細(xì)胞；將特異性傳染顆?；蚬δ苄缘鞍踪|(zhì)傳遞給受體細(xì)胞；直接在細(xì)胞間進(jìn)行受體轉(zhuǎn)移等。在生理機(jī)制下，間充質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體有利于軸突的發(fā)育，星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體可以選擇性分泌神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞存活。在病理作用下，一些外泌體又可能具有傳播或清除毒性物質(zhì)的作用，如AD中的β淀粉樣蛋白(β- amyloid protein，Aβ)和Tau蛋白，以及亨廷頓病中的多聚谷氨酰胺蛋白和大量重復(fù)的RNA，在神經(jīng)退行性疾病中，蛋白質(zhì)突變導(dǎo)致錯(cuò)誤分選或錯(cuò)誤折疊，同時(shí)Aβ和Tau蛋白降解途徑受阻，造成外泌體攜帶錯(cuò)誤折疊或突變后的有毒蛋白質(zhì)擴(kuò)散，推動(dòng)退行性神經(jīng)疾病的形成并不斷演化[11]。

2 外泌體參與AD的發(fā)病機(jī)制

外泌體在AD病理過程中的作用包括參與Aβ的代謝、傳播、聚集、清除以及對(duì)Tau蛋白的傳播和轉(zhuǎn)運(yùn)，這早在2006年就已被Rajendran等[12]證實(shí)。除了Aβ外，神經(jīng)退行性疾病也會(huì)受磷酸化Tau蛋白的影響。作為腦微管相關(guān)蛋白，Tau蛋白能直接結(jié)合微管并調(diào)節(jié)其結(jié)構(gòu)和功能[13]。Tau蛋白在磷酸化過度條件下會(huì)將神經(jīng)原纖維纏結(jié)觸發(fā)，并參與神經(jīng)退行性疾病的擴(kuò)散。Asai等[14]對(duì)兩種Tau蛋白小鼠模型(AAV- Tau蛋白注射模型和轉(zhuǎn)基因PS19模型)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，減少小膠質(zhì)細(xì)胞可以抑制Tau蛋白的傳播，且抑制外泌體的合成也可以減少Tau蛋白的傳播，可見小膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體是在神經(jīng)細(xì)胞中傳播Tau蛋白的重要工具。此外，與外泌體相關(guān)的磷酸化Tau蛋白也可分別從AD患者血液和腦脊液中分離出來[15]。Polanco等[16]實(shí)驗(yàn)表明，從小鼠腦細(xì)胞外間隙分離的外泌體樣囊泡中的Tau蛋白所占比例較高，且其已出現(xiàn)一定程度的磷酸化。這表明，外泌體參與了Tau蛋白的運(yùn)輸和傳播。因此，外泌體與淀粉樣物質(zhì)和Tau蛋白傳播有關(guān)是造成AD細(xì)胞毒性和神經(jīng)病變蔓延的機(jī)制之一[17]。且其他神經(jīng)退行性疾病(帕金森病)的研究也得出類似結(jié)論[18]。Sarkar等[19]在AD實(shí)驗(yàn)小鼠和AD患者的相關(guān)腦區(qū)內(nèi)均發(fā)現(xiàn)miR- 34a高表達(dá)，鄰近神經(jīng)元細(xì)胞攝取高表達(dá)miR- 34a的外泌體后，整合素- 金屬蛋白酶10、沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1基因被miR- 34a靶向阻斷，Aβ出現(xiàn)并沉積。

也有研究認(rèn)為，外泌體在Aβ的病理和功能影響中也有有益作用。An等[20]和Falker等[21]的研究顯示，小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分泌的外泌體可以消除AD患者腦中Aβ斑塊對(duì)突觸可塑性的破壞。Yuyama等[22]認(rèn)為，細(xì)胞外的外泌體(神經(jīng)元分泌)對(duì)Aβ構(gòu)象產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，使Aβ向淀粉樣纖維(無毒)轉(zhuǎn)變，且對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞攝取Aβ有促進(jìn)作用，細(xì)胞內(nèi)的Aβ則被外泌體運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行降解。在后續(xù)研究中，他們將外泌體注入AD轉(zhuǎn)基因小鼠的腦部發(fā)現(xiàn)，注入的外泌體可以誘導(dǎo)Aβ被小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬[23]。此外，在APP/PS1大鼠模型認(rèn)知功能改善的實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過缺氧處理的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體中的促炎因子(腫瘤壞死因子- α、白細(xì)胞介素- 1)水平下降，但抗炎因子(白細(xì)胞介素- 4、白細(xì)胞介素- 10)水平升高，說明外泌體可通過抑制炎癥反應(yīng)來減緩AD發(fā)展[24]。

可見，外泌體在AD中可能具有“雙面性”，既可促進(jìn)淀粉樣物質(zhì)、Tau蛋白等毒性物質(zhì)的傳播，也可減輕病理性損傷。因此，由各種細(xì)胞分泌的功能不一的外泌體可能對(duì)機(jī)體的代謝平衡起維持和調(diào)節(jié)作用，這種動(dòng)態(tài)平衡的失衡導(dǎo)致病理狀態(tài)的出現(xiàn)。

3 外泌體在AD診斷中的價(jià)值

作為神經(jīng)性退行性進(jìn)展疾病之一，臨床已采用影像學(xué)和神經(jīng)心理學(xué)測試來輔助診斷AD，但大多數(shù)AD患者前階段可能是無癥狀的，且這個(gè)階段最長可達(dá)17年[25]。目前，腦脊液內(nèi)的Tau蛋白、Aβ是臨床診斷AD的主要標(biāo)志物，由于在AD患者腦脊液/血漿中提取的外泌體中發(fā)現(xiàn)了與疾病相關(guān)的蛋白，所以外泌體在臨床已被作為AD的生物標(biāo)志物之一。Fiandaca等[15]通過對(duì)血漿中神經(jīng)細(xì)胞來源的外泌體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中的p- T181- tau、p- S396- tau和Aβ1～42在臨床發(fā)病前數(shù)年即可對(duì)AD做出預(yù)測。此外，可以通過檢測外泌體中Aβ的表達(dá)水平監(jiān)測AD的發(fā)病情況。

Goetzl等[26]對(duì)28名正常人、16例額顳葉癡呆患者和12例AD患者進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，只有AD患者的突觸素1和生長相關(guān)蛋白43水平下降。這證實(shí)，對(duì)于AD可能可將神經(jīng)細(xì)胞外泌體突觸蛋白作為其臨床預(yù)測指標(biāo)。

Vesiclepedia數(shù)據(jù)庫列出了在33種外泌體中發(fā)現(xiàn)的兩萬多種信使RNAs和近五千種 miRNAs，包括病毒RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA片段、小核RNA、核仁小RNA、Piwi互作RNA、非編碼RNAs等[27]，這些被稱為外泌體源性RNAs可成為AD診斷的新標(biāo)志物。

外周血中外泌體攜帶的miRNAs因充分保有源神經(jīng)細(xì)胞分泌時(shí)的內(nèi)容物而逐漸成為新的AD生物診斷標(biāo)志物[28]。Lugli等[29]采集了35例AD患者的血清提取其外泌體中的miRNAs，并篩選出20個(gè)表現(xiàn)有顯著差異的miRNAs，其中miR- 342- 3p被認(rèn)為是獨(dú)立診斷AD的生物標(biāo)志物。另一項(xiàng)試驗(yàn)將AD 患者、輕度認(rèn)知障礙患者與健康對(duì)照者血清中的外泌體進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，14種miRNAs表達(dá)上調(diào)，3種miRNAs(miR- 1306- 5p、 miR- 342- 3p、miR- 15b- 3p)表達(dá)下調(diào)[30]。Yang等[31]在107例AD患者與正常對(duì)照者的對(duì)照試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，血清外泌體中的miR- 135a和miR- 384表達(dá)上調(diào)，但miR- 193b的表達(dá)下調(diào)。Riancho等[32]報(bào)道，AD患者腦脊液外泌體源性RNAs表達(dá)譜中15個(gè)miRNAs發(fā)生明顯變化，其中正常對(duì)照者50%與70%的樣品中分別檢測出miR- 9- 5p與miR- 598，而所有AD患者樣品中均未檢測到，提示miR- 9- 5p與 miR- 598可能是AD潛在的標(biāo)記分子?？梢?，miRNAs作為診斷生物標(biāo)志物具有廣闊的發(fā)展空間。

腦脊液、血液、尿液、血漿、血清中均可以提取出miRNAs，其提取可通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)、基因芯片、深度測序技術(shù)完成，而作為AD標(biāo)志物循環(huán)中的miRNAs可通過新一代高通量測序技術(shù)識(shí)別。

4 外泌體與AD的治療

研究表明，細(xì)胞外囊泡的關(guān)鍵特征是它們可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周循環(huán)之間傳播，其既可被當(dāng)成清除有毒蛋白質(zhì)的平臺(tái)，也可以繞開血腦屏障，故使得改良的細(xì)胞外囊泡可成為獨(dú)特的藥物輸送方式[33]。外泌體具有的基本特征包括：①外泌體本身屬于一種膜性囊泡(來自于細(xì)胞分泌)，這使得它們具有生物運(yùn)輸載體的特性[34]；②外泌體能在相鄰細(xì)胞或器官之間運(yùn)輸特有的內(nèi)容物；③外泌體可以有效地穿透血管屏障[35]。且外泌體作為治療方式也是安全可控的：①外泌體不能夠自我復(fù)制，不會(huì)像瘤細(xì)胞樣轉(zhuǎn)移；②外泌體是一種脂質(zhì)囊泡，其可以運(yùn)載人工合成的內(nèi)容物，在生物工程中可以進(jìn)行質(zhì)量和劑量控制；③治療用的外泌體可以取自患者自身，從而避免了潛在的免疫并發(fā)癥。這些特性使得外泌體可成為一種治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新方式、新載體。

神經(jīng)元漸進(jìn)性丟失，神經(jīng)原纖維纏結(jié)，Aβ沉積過度，這是AD具有的典型特征。腦啡肽酶能降解Aβ的沉積，有試驗(yàn)利用間充質(zhì)干細(xì)胞分泌含有腦啡肽酶的外泌體，通過核外遞送的方式運(yùn)輸至大腦發(fā)現(xiàn)，其可以減少Aβ積累，減輕AD的癥狀[36]。將這種方式運(yùn)用于靶向治療，已在小鼠模型中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。Katsuda等[36]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 脂肪干細(xì)胞來源的外泌體中存在腎胰島素殘基溶酶的高表達(dá), 而這種酶可有效降低大腦中Aβ的水平，進(jìn)而減少Aβ積累。

β- 淀粉樣前體蛋白裂解酶1隸屬于蛋白酶家族，其可有效裂解淀粉樣前體蛋白N端，從而造成Aβ積累。Alvarez- Erviti等[37]利用電穿孔法將載有干擾小RNA的樹突狀細(xì)胞來源的外泌體通過血腦屏障輸送至大腦，結(jié)果造成信使RNA和β- 淀粉樣前體蛋白裂解酶1呈劑量依賴性顯著下調(diào)，從而減少Aβ積累，緩解了AD的病理進(jìn)程。

Wang等[38]發(fā)現(xiàn)，短發(fā)夾RNA介導(dǎo)的前列腺凋亡反應(yīng)蛋白- 4下調(diào)可以使凋亡減輕，前列腺凋亡反應(yīng)蛋白- 4是一個(gè)對(duì)鞘脂神經(jīng)酰胺敏感的蛋白。淀粉樣肽可以誘導(dǎo)富含前列腺凋亡反應(yīng)蛋白- 4/C18神經(jīng)酰胺的外泌體分泌，但在缺乏中性鞘磷脂酶2的星形膠質(zhì)細(xì)胞中沒有觀察到凋亡，說明由中性鞘磷脂酶2產(chǎn)生的神經(jīng)酰胺對(duì)于細(xì)胞凋亡很重要，故認(rèn)為中性鞘磷脂酶2是AD的潛在藥物治療靶點(diǎn)。后續(xù)試驗(yàn)也證明，通過藥物抑制中性鞘磷脂酶2，AD患者淀粉樣斑塊在腦部的沉積量下降[38]。此外，通過增加5XFAD小鼠血清中的神經(jīng)酰胺抗體，可以減少Aβ沉積和降低血清中的外泌體水平[39]。

實(shí)驗(yàn)表明，有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練歷時(shí)150 d后的轉(zhuǎn)基因組小鼠(APP/PS1)認(rèn)知功能顯著超過對(duì)照組；其腦內(nèi)的Aβ淀粉樣斑塊顯著減少，Aβ代謝關(guān)鍵酶β- 淀粉樣前體蛋白裂解酶1蛋白水平顯著下降，ADAM10蛋白水平明顯提高，提示運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能促進(jìn)了腦內(nèi)Aβ的代謝[40]。另外，小鼠腦內(nèi)多囊泡體水平明顯升高，提示運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能促進(jìn)外泌體的產(chǎn)生和釋放[40]。

5 小 結(jié)

外泌體的生物利用度及其內(nèi)在的生物特性使得它們成為很有潛力的治療方式，外泌體進(jìn)入細(xì)胞有多種路徑,每一種進(jìn)入方式均需評(píng)估其是否是最有效的一種方式，而外泌體可以被設(shè)計(jì)以“編碼”的方式進(jìn)入[41]。但利用外泌體進(jìn)行生物治療仍存在很多問題，如外泌體的承載能力及其內(nèi)容物的半衰期需要明確；要從藥理學(xué)的方面考慮外泌體的劑量和生物學(xué)分布；外泌體在受體細(xì)胞的攝取動(dòng)力學(xué)；外泌體的治療性遞送是否需要囊泡表面有配體，以提高靶目標(biāo)的結(jié)合、增加遞送的成功率等。未來對(duì)外泌體生物學(xué)的深入研究，將為AD的治療提供新思路。