葉 慧,郝海平

0 引 言

腫瘤中代謝物水平與正常細胞相比存在顯著差異。越來越多的研究表明，致癌信號通路與代謝活動之間存在緊密聯(lián)系［1-2］，代謝重編程在癌癥中的重要性正日益得到承認。代謝重編程使腫瘤細胞高度依賴于特定代謝通路、代謝酶，而代謝物除了作為代謝轉化中的中間體，也可通過直接或間接作用進一步觸發(fā)腫瘤細胞的多種信號通路，對蛋白網絡進行調控。研究表明，代謝物在細胞內往往存在多個作用靶標，而同一靶蛋白同時也可受到多種代謝物的共同調節(jié)［3］。因此，在復雜的腫瘤代謝網絡中明確功能性代謝物的作用靶標與調節(jié)機制成為腫瘤靶向治療的新途徑。隨著質譜技術的發(fā)展，其在小分子靶標發(fā)現(xiàn)領域顯示出卓越的優(yōu)勢。目前，基于質譜的小分子藥物靶標發(fā)現(xiàn)方法按照是否對小分子進行官能基團的修飾這一標準可分為非修飾及修飾的靶標發(fā)現(xiàn)方法。也有研究者將這些方法應用于內源性代謝物的靶蛋白發(fā)現(xiàn)的研究中［4-5］。為促進內源性代謝物靶標發(fā)現(xiàn)在腫瘤靶向治療策略開發(fā)中的研究，本文將對腫瘤內代謝紊亂的特點，代謝調節(jié)對腫瘤的影響及現(xiàn)有基于質譜的內源性代謝物靶標發(fā)現(xiàn)方法進行闡述，以突出內源性代謝物在腫瘤治療中的關鍵作用，為腫瘤治療提供新方向。

1 代謝調控治療腫瘤

在正常生理條件下，細胞的能量來源于葡萄糖的氧化分解，而在缺乏氧氣的生理條件下，細胞的能量來源會切換至葡萄糖的糖酵解通路。早在20世紀初時，Warburg［6］研究發(fā)現(xiàn)，即使處于氧氣足夠的環(huán)境之中，腫瘤細胞依然選擇以糖酵解的方式為生長提供能量，即著名的Warburg效應。谷氨酰胺分解是腫瘤細胞第二大能量來源方式，其催化、脫氫過程中的中間產物可參與三羧酸底物循環(huán)，從而為腫瘤細胞供能［7］。此外，腫瘤細胞為了維持自身增殖所需的高能量，也會增強脂質代謝通路［8］。這種腫瘤代謝模式的重編程現(xiàn)象的終極目的是為了滿足腫瘤快速生長和增殖過程中所需要的大量能量和生物合成原料［6］。

基于腫瘤與正常組織相比的代謝差異，研究人員嘗試靶向腫瘤細胞內能量代謝通路，以期通過阻斷供能通路產生抗腫瘤作用，實現(xiàn)腫瘤靶向治療。如Wang等［9］針對絲氨酸合成通路中磷酸甘油脫氫酶（phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH）進行結構及其功能研究，通過設計小分子肽抑制劑靶向調控腫瘤代謝中的絲氨酸合成通路以治療腫瘤。目前已有PHGDH的靶向制劑NCT-502和NCT-503能夠通過靶向絲氨酸合成通路對抗腫瘤［10］?；谕ㄟ^精準靶向腫瘤中異?；钴S的糖代謝、NAD+合成、谷氨酰胺代謝、脂肪酸合成等腫瘤代謝通路來抑制腫瘤生長的策略，目前已有多種代謝酶抑制劑/激活劑類藥物正處于臨床或臨床前研究階段［11-12］。

除經典的糖酵解、谷氨酸代謝通路，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞內某些內源性代謝物能夠通過結合并非其上下游合成/代謝酶等新靶標調控其活性，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和免疫調節(jié)中發(fā)揮作用［4］。如2-羥基戊二酸（2HG）是異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突變的產物，在膠質母細胞瘤中由于IDH酶的突變產生蓄積。Evans和Griner［13］研究發(fā)現(xiàn)，2HG可以通過競爭性結合α-酮戊二酸依賴的酶，導致包括組蛋白去甲基化酶、甲基胞核嘧啶雙氧化酶和脯氨酸羥化酶等活性失調，進而導致腫瘤發(fā)生全基因組組蛋白和DNA甲基化改變。目前，針對介導2HG代謝物生成的IDH酶突變體開發(fā)的Enasidenib已獲批用于治療急性髓性白血病。這提示我們研究腫瘤中異常表達的致癌代謝物2-HG及其作用靶標為腫瘤治療提供了新的策略和途徑。

在免疫調節(jié)方面，Kornberg等［14］曾發(fā)現(xiàn)富馬酸二甲酯可以催化糖酵解代謝酶GAPDH琥珀?；蛊涫Щ?，從而下調活化的髓細胞和淋巴細胞中的有氧糖酵解，介導其抗炎作用，揭示了富馬酸二甲酯對免疫調節(jié)的機制作用。Galván-Pe?a等［15］學者研究發(fā)現(xiàn)內源性代謝物丙二酰輔酶A在LPS刺激的巨噬細胞中催化GAPDH丙二?；?，釋放與GAPDH結合的TNFαmRNA，促進TNFα翻譯，進一步加重炎癥。Geiger等［16］學者發(fā)現(xiàn)內源性代謝物L-精氨酸參與調節(jié)T細胞代謝。激活的T細胞中L-精氨酸含量的提升可誘導細胞代謝方式從糖酵解轉變?yōu)檠趸姿峄龠MT細胞存活。進一步，該研究在體外和體內模型均證實了T細胞內的精氨酸濃度直接影響了其代謝適應性與存活能力，進而發(fā)揮抗腫瘤活性，在體抑制腫瘤的生長。因此，對于免疫細胞的代謝物靶標發(fā)現(xiàn)為通過激活腫瘤患者的免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤活性的治療策略提供了新的可能。

上述研究均表明，通過調控腫瘤及免疫細胞代謝對抗腫瘤的研究策略對于抗腫瘤藥物研發(fā)具有巨大的科學和轉化價值。然而，大多數(shù)在腫瘤中異常表達的功能性代謝物的作用靶標及對機體的調控機制尚不明確，對其直接作用靶標認識的缺失阻礙了通過調控腫瘤和免疫代謝進行抗腫瘤藥物研發(fā)的深入，提示我們針對內源性代謝物的體內作用靶標發(fā)現(xiàn)技術亟待突破。

2 內源性代謝物靶標發(fā)現(xiàn)方法

腫瘤細胞會通過代謝模式的改變來適應自身增殖的需要。鑒于闡明致癌信號通路與代謝活動之間復雜的相互作用機制在抗腫瘤藥物研發(fā)中的重要作用，建立調控腫瘤代謝的關鍵內源性代謝物的靶標發(fā)現(xiàn)方法將成為腫瘤精準治療研究的關鍵技術和突破口。

2.1非修飾方法尋找內源性代謝物靶標藥物親和致靶點穩(wěn)定性（drug affinity responsive target stability，DARTS）是不對目標化合物進行修飾的靶標發(fā)現(xiàn)策略中經典的方法之一。2009年，Lomenick等［17］基于小分子與靶蛋白的親和作用增加靶蛋白結構的穩(wěn)定性，從而抵抗蛋白酶水解這一原理，基于凝膠電泳、染色和質譜鑒定識別出目標小分子的作用靶點。該方法的優(yōu)點在于不僅不需要標記和修飾目標分子，還能廣泛應用于各種天然狀態(tài)的生物體系。2017年，Li等［18］采用DARTS方法，運用代謝組學和蛋白質組學技術發(fā)現(xiàn)了內源性小分子代謝物丁酸的靶蛋白丙酮酸激酶，闡明丁酸通過誘導結腸癌細胞的代謝重排，限制其增殖所需的生物原料的獲得，最終抑制結腸癌細胞增殖的代謝調控機制。盡管應用廣泛、操作簡便，但DARTS方法有自身的局限性，包括不適合用于發(fā)現(xiàn)與目標分子的結合親和力較弱的靶蛋白，以及無法用于發(fā)現(xiàn)與靶分子結合后構象沒有發(fā)生顯著性變化的靶標等問題。

細胞熱轉變分析（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）是基于目標小分子與靶蛋白結合后靶蛋白的熱穩(wěn)定性增加，借助定量質譜技術發(fā)現(xiàn)和識別目標分子結合的靶蛋白。該技術能在天然的細胞環(huán)境中進行，也無需對目標分子和蛋白進行任何修飾以及標記。目前已證實該技術能識別許多已知的抗癌試劑的靶點，如在細胞裂解液、完整細胞或組織樣本中均鑒定出甲氨喋呤、雷替曲塞、TNP-470的作用靶標。在內源性代謝物方面，Hashimoto等［19］驗證了內源性小分子L-乳酸可以與跨膜蛋白SLC16A1結合并起到穩(wěn)定蛋白構象的作用。然而，CETSA方法不適用于高度不均勻的蛋白質或蛋白質配體結合域的結構展開，并不會誘導蛋白的聚集和變性的情況，如DNA和伴侶蛋白質的結合［20-21］。

蛋白有限水解質譜（Limited Proteolysis-Mass Spectrometry，LiP-MS）通過在復雜生物體系中識別由于配體結合引起蛋白質結構的改變，導致限制性酶切程度的變化，從而識別出藥物結合的靶蛋白及其作用位點。該方法的優(yōu)點在于當與靶向蛋白組學測量工具串聯(lián)使用時，可在蛋白質組層面實現(xiàn)高靈敏度、可重復性、高通量的靶點篩選，且不需要對配體進行化學修飾［22］。Feng等［3］通過LiP技術發(fā)現(xiàn)內源性代謝物FBP可以通過結合Cdc19蛋白改變其構象并進一步激活其代謝酶活性，此外還鑒定出內源性代謝物FBP新的靶蛋白Fas1/2，并在體外實驗中驗證了FBP對其酶活的影響。然而，LiP-MS對靶標的檢測受靶蛋白豐度的影響，當靶蛋白以較低的豐度存在于復雜的生物基質中，LiP-MS對靶標的檢測存在難度［20］。此外，限制性酶切質譜方法提供的結構信息有限，且在對細胞中蛋白的處理過程中可能會引起靶蛋白的結構改變，從而產生假陽性結果的可能性難以完全規(guī)避［23］。

與上述方法相比，非變性質譜技術是一種非標記的分析技術，其特點在于能夠直接觀測到目標分子與靶蛋白的結合。該技術利用電噴霧電離將非共價復合物從溶液中轉移到氣相中，再通過測量配體和蛋白復合物的信號，并結合計量數(shù)獲取目標分子與靶蛋白結合的親和力［24-25］。Gan等［26］通過非變性質譜技術發(fā)現(xiàn)細胞裂解液中PHGDH可與4個NAD+分子結合，氧化還原酶CBR3蛋白也存在與NADPH結合的形式，發(fā)現(xiàn)了NADPH的新結合靶點。此外，Zheng等［27］還基于非變性質譜技術，開發(fā)了原態(tài)-變性交換質譜（Native-Denatured Exchange-Mass Spectrometry，NDX-MS）的方法，實現(xiàn)進一步區(qū)分特異性和非特異性的相互作用，以期發(fā)現(xiàn)小分子的特異性結合蛋白［28］。但該方法對儀器的要求較高，對樣品的純度以及同質性方面的要求也對其廣泛應用于靶標篩選有所限制。

2.2基于修飾目標分子的方法尋找內源性代謝物靶標親和純化色譜是用于識別蛋白質和配體相互作用最為經典并廣泛使用的方法之一。傳統(tǒng)的親和層析是將感興趣的目標藥物或小分子配體通過可衍生化的官能團固定在固相基質上，將修飾后的固相介質與細胞裂解液孵育，使得藥物或小分子選擇性的與靶蛋白結合，用洗脫液除去不與目標小分子結合的蛋白，利用變性劑或競爭性的游離藥物洗脫靶蛋白，進而用質譜鑒定靶標［29-30］。該方法成功運用于多種小分子的靶標發(fā)現(xiàn)研究。Trzoss等［31］發(fā)現(xiàn)天然產物半醌對黑色素瘤細胞系具有選擇性細胞毒作用，通過親和純化色譜方法鑒定出其結合的靶蛋白為皮離蛋白。該作用靶標的明確為開發(fā)治療黑素瘤提供了新思路，而使用皮離蛋白作為開發(fā)靶向療法的生物標志物則可以加速個性化治療的發(fā)展。但由于該策略的開始依賴于對目標化合物的修飾，而對目標小分子的修飾有可能會干擾其與靶蛋白的相互作用，故也存在局限。

基于親和力的蛋白質分析（Affinity-based protein profiling，ABPP）是目前用于藥物靶標鑒定的前沿化學蛋白質組學技術。它主要通過開發(fā)基于小分子結構進行化學修飾，如與熒光基團、親和基團的連接而成的探針。該類探針能夠在細胞環(huán)境直接與潛在的靶蛋白共價結合，或基于光交聯(lián)反應與靶蛋白產生共價結合，通過親和富集或通過凝膠電泳對與目標小分子產生結合的蛋白進行鑒定，即可獲取目標分子的靶標信息。該類親和探針在鑒定低豐度靶標方面有優(yōu)異的能力，并能獲取在細胞及組織內與目標分子產生原位親和作用的靶蛋白信息。Hulce等［32］通過使用光親和性甾醇類探針結合定量質譜方法，在HeLa細胞中鑒定出超過250種膽固醇的結合蛋白，并驗證出其中7個代表性蛋白與膽固醇之間的相互作用。Moraru等［33］通過合成了糖代謝的副產物丙酮醛（methylglyoxal，MGO）探針，發(fā)現(xiàn)MGO的靶標為脂肪酸合成酶，闡明了由于MGO生成增加或是MGO解毒機制受阻引起的MGO水平上升抑制胰島素信號誘導2型糖尿病的發(fā)病機制。

3 代謝物作用靶標的發(fā)現(xiàn)在開發(fā)腫瘤精準治療新策略中的前景

由于疾病的異質性和患者的個體差異不同，腫瘤個體對藥物的敏感性和耐藥性也存在顯著差異。為向患者提供副作用小而又最為有效的治療，腫瘤精準治療的概念應運而生。鑒于腫瘤細胞內明顯的代謝重編程與腫瘤惡性程度、浸潤和轉移能力等特點密切相關，靶向腫瘤中異?；钴S的代謝通路成為精準抗腫瘤藥物的新靶點［34］。另一方面，在給予傳統(tǒng)化療藥物的同時，共同給予代謝酶抑制劑/激活劑類小分子調節(jié)腫瘤代謝狀態(tài)能夠顯著增強抗腫瘤藥效，如抗腫瘤藥物mTOR通路抑制劑雷帕霉素與糖酵解通路阻斷劑3-BrOP的聯(lián)用能夠顯著增強其對淋巴瘤與白血病細胞的殺傷能力［35］；降低葡萄糖水平能夠增加多種腫瘤細胞系對5-FU和順鉑的藥物耐藥性［36］；L1210細胞中二氫葉酸水平的升高能夠逆轉甲氨喋呤對二氫葉酸還原酶的抑制作用等［37］。但這種代謝水平變化增敏化療藥物的機制尚不完全明確。

因此，在“談癌色變”的今天，深入探究腫瘤細胞中代謝重編程現(xiàn)象導致的內源性代謝物失衡，并基于修飾和非修飾蛋白組學進行代謝物的靶標發(fā)現(xiàn)研究，以探尋代謝物平衡失調與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關聯(lián)的機制，進而根據(jù)腫瘤內源性代謝物在體內的作用靶標，促進基于代謝靶標的新藥研發(fā)或開發(fā)與傳統(tǒng)化療藥物共同給藥的新模式這一研究方向具有重要的科學和轉化價值，為臨床腫瘤患者的個性化精準治療提供了新的視角。