魏 娟，戚 星，邢晉祎，徐 敏，孫煒涵

(臨沂大學生命科學學院，臨沂276000)

葉酸是指具有蝶酰谷氨酸結(jié)構(gòu)的一類水溶性族維生素，普遍存在于各種動植物食品中，是人體和動物維持健康成長和發(fā)育的必需維生素之一。葉酸代謝途徑在細胞增殖中發(fā)揮重要作用，該途徑中所必需的酶一直是癌癥治療靶點的熱門研究對象，其中MTHFD2基因(Methylene tetrahydrofolate dehydrogenase 2，亞甲基四氫葉酸脫氫酶2)逐漸成為研究熱點。MTHFD2蛋白定位于線粒體，是一種雙功能酶，具有亞甲基脫氫酶和環(huán)化水解酶雙重活性，為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依賴性酶，參與NADH的產(chǎn)生，能夠催化由亞甲基四氫葉酸和NAD+產(chǎn)生N-10-甲?；?四氫葉酸和NADH的反應(yīng)[1-2]。在快速生長的癌癥細胞中，MTHFD2蛋白是嘌呤合成中甲基鹽的主要來源[1-2]。 MTHFD2蛋白也是催化5，10-甲基-四氫葉酸和10-甲酰四氫葉酸相互轉(zhuǎn)化的酶[3]。人類MTHFD2基因被定位在2號染色體上[4]，雞MTHFD2基因被定位在22號染色體[5]。最新研究表明：MTHFD2基因的過表達與腫瘤細胞的增殖和乳腺癌的不良預后有關(guān)[1，6]，所以有學者提出把MTHFD2蛋白作為藥物開發(fā)的新靶標[1]。

雞作為模式生物在醫(yī)學研究領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。本研究以肉雞為研究對象，克隆MTHFD2基因，并對其進行生物信息學分析，用定量PCR對其在不同組織的表達譜進行研究，旨在為進一步研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)，也為預測某些癌癥疾病的發(fā)生和術(shù)后復發(fā)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)，UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]，EcoRⅠ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶(NEB公司)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Trizol Reagent和RNase Inhibitor(Invitrogen公司)，pMD19-T vector 、SYBR? Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)和LA Taq DNA聚合酶(Takara公司)。

1.2 實驗動物及樣品采集

試驗于2016年2—4月在臨沂大學山東省生物學實驗教學示范中心完成。隨機挑選5只42日齡愛拔益加(Arbor acres，AA)肉雞，屠宰前空腹12 h，可自由飲水。屠宰后采集肝臟、心臟、胸肌、腿肌、腎臟、脾臟、肺臟和腹脂，用磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline，PBS)沖去殘留血液，切割成0.5—1 g小塊，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗方法

1.3.1 組織總RNA的抽提和cDNA第一鏈的合成

組織總RNA提取采用Trizol法，按照Trizol試劑盒說明書進行。 cDNA第一鏈的合成利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成，操作方法按照說明書進行。

1.3.2 引物設(shè)計和RT-PCR擴增

引物設(shè)計：根據(jù)GenBank上原雞MTHFD2基因(NM_001031360)序列，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計引物MTHFD2-F和MTHFD2-R；根據(jù)測序得到的序列設(shè)計熒光定量PCR(qPCR)基因表達引物(Exp-F、Exp-R)；以管家基因β-actin(GenBank：NM_205518)為內(nèi)參，設(shè)計引物β-actin-F和β-actin-R，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 PCR引物序列、退火溫度、擴增片段大小

PCR反應(yīng)體系：在PCR管中加入1.0 μL模板cDNA(50 ng/μL)，2.5 μL 10×LA反應(yīng)緩沖液，2.0 μL dNTP mix(每種2.5 mmol/L)，2.0 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.4 μL MTHFD2-F(20 μmol/L)，0.4 μL MTHFD2-R(20 μmol/L)，0.2 μL(1 U)LA Taq DNA聚合酶，ddH2O補齊至25 μL，吹打混勻后稍離心片刻。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物檢測：配制1.2% 瓊脂糖，120V電泳檢測，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.3.3 克隆轉(zhuǎn)化與測序

上述PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收目的片段，純化產(chǎn)物與pMD19-T Vector于16 ℃連接30 min，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，然后涂布于含有Amp、IPTG和X-gal的平板上培養(yǎng)過夜，挑取白斑菌落于3 mL LB培養(yǎng)基中 (含3 μL Amp)，37 ℃搖12—16 h。提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切鑒定，至少挑取3個陽性克隆菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3.4MTHFD2基因的生物信息學分析

將測序獲得的序列用DNAMAN軟件尋找開放閱讀框(Open read frame，ORF)，推測氨基酸序列，并比較與其他動物MTHFD2的氨基酸序列同源性；在NCBI網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上分析保守域等；用MEGA 5.05 軟件采用鄰近法構(gòu)建進化樹。利用ExPASy(http：//www.expasy.org)分析蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)疏水性、親水性、蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)和三級結(jié)構(gòu)等。

1.4 利用定量PCR(qPCR)分析MTHFD2基因表達水平

采用SYBR Green I 染料法，進行qPCR分析，以雞管家基因β-actin為內(nèi)參，分析MTHFD2基因在不同組織中的mRNA表達水平。

qPCR反應(yīng)體系：10 μL SYBR? Premix Ex TaqTMII，1 μL cDNA(稀釋10倍)，0.2 μL Exp-F和0.2 μL Exp-R引物，滅菌超純水加至20 μL。qPCR反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min； 94 ℃ 10 s，57(55)℃ 10 s，72 ℃ 1 s，40個循環(huán)。每個循環(huán)后采集熒光生成擴增曲線。試驗對所有樣本進行3個重復測定，并在每次試驗時設(shè)陰性對照。根據(jù)熒光曲線的Ct值及標準曲線，以雞β-actin基因為內(nèi)參，用2-△△ct法計算MTHFD2基因的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SAS version 8.2 統(tǒng)計軟件對MTHFD2基因的相對表達量進行多重比較統(tǒng)計分析，結(jié)果用“平均值±標準誤”表示。當P<0.05時，差異達到顯著水平；當P<0.01時，差異達到極顯著水平。

1—3泳道為MTHFR2基因PCR產(chǎn)物；M：DL2000 DNA maker圖1 肉雞MTHFD2基因PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR products of broiler MTHFD2

2 結(jié)果與分析

2.1 MTHFD2基因的克隆和序列分析

以42日齡肉雞肝臟cDNA為模板，用MTHFD2-F和MTHFD2-R引物擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到一條特異性帶(圖1)，測序后確認長度為1 554 bp，包含雞MTHFD2基因mRNA開放閱讀框(1 014 bp)和部分5’UTR(45 bp)、3’UTR(495 bp)序列，與GenBank上注冊的原雞序列(NM_001031360)有11 bp的差異，其中有10 bp的插入片段，該插入片段位于終止密碼子之后，所以不編碼氨基酸(圖2)。該序列編碼337個氨基酸(圖2)，氨基酸序列與其他物種比較結(jié)果見表2。從表2可見，雞與日本鵪鶉的氨基酸序列一致性最高，達到97.33%，與山羊的一致性最低。這些結(jié)果表明，MTHFD2蛋白在鳥類之間具有高度保守性。將氨基酸序列使用MEGA 5.05 軟件采用鄰近法構(gòu)建分子進化樹，結(jié)果表明雞與日本鵪鶉聚為一類，進一步說明雞與日本鵪鶉的親緣關(guān)系較近(圖3)。

表2 雞和其他物種間MTHFD2氨基酸序列一致性比較

圖2 肉雞MTHFD2基因序列與GenBank注冊序列(NM_001031360)比對Fig.2 Alignment of MTHFD2 gene sequences between broiler and GenBank (NM_001031360)

注：0.02代表遺傳距離，每個節(jié)點的數(shù)字表示1 000次重復后的靴帶百分比圖3 MTHFD2蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic tree of MTHFD2

2.2 MTHFD2理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)預測

利用ExPASy(http：//www.expasy.org)分析結(jié)果表明，雞MTHFD2蛋白相對分子質(zhì)量和等電點(PI)分別為36 411.44和9.51。雞MTHFD2氨基酸組成表明，丙氨酸占的比例最高(11.0%)，包含34個負電荷氨基酸殘基(天冬氨酸+谷氨酸)和44個正電荷氨基酸殘基(精氨酸+賴氨酸)。不穩(wěn)定指數(shù)為25.86，屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為 103.32，親水性平均系數(shù)為-0.066，屬于親水蛋白。用TMHMM程序?qū)﹄uMTHFD2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白位于胞外，不具備跨膜結(jié)構(gòu)。利用SOPMA程序預測MTHFD2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)表明，α-螺旋占31.16%，延伸鏈(即β-片層結(jié)構(gòu))占22.26%，β-轉(zhuǎn)角占9.2%，無規(guī)卷曲占37.39%，即主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主。 三級結(jié)構(gòu)分析表明，以1b0a.1.A為模板，序列一致性為48.94%(圖4)。

2.3 MTHFD2基因組織表達譜分析

利用qPCR技術(shù)檢測MTHFD2基因在肉雞肝臟、脂肪、腎臟、脾臟、肺臟、心臟、胸肌和腿肌組織中的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MTHFD2基因在所檢測的8種組織中均有表達，在腿肌中的表達水平最高，在肝臟中的表達水平最低，且在胸肌和腿肌中的表達水平極顯著高于其他組織(P<0.01)。

圖4 雞MTHFD2蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.4 Chicken MTHFD2 protein three-dimensional model

圖5 雞MTHFD2基因的表達水平Fig.5 Expression levels of chicken MTHFD2

3 討論

在本研究中，從AA肉雞肝臟中克隆得到雞MTHFD2基因cDNA的部分序列(1 554bp)，所擴增的序列與GenBank上(NM_001031360)注冊的原雞核苷酸序列一致性為99.29%，氨基酸一致性為100%。值得注意的是，與GenBank上注冊的序列相比在終止密碼子之后發(fā)現(xiàn)有10bp的插入片段，這可能是MTHFD2基因的不同轉(zhuǎn)錄變異體，這個插入片段對MTHFD2基因的結(jié)構(gòu)和功能以及雞的生長發(fā)育是否有影響，需要進一步研究。另外，試驗對MTHFD2基因在不同組織中的表達水平進行了分析，為進一步研究MTHFD2基因的功能奠定了基礎(chǔ)，也為葉酸代謝相關(guān)酶在疾病治療中提供參考。

目前，對MTHFD2基因功能的研究主要集中在人類癌癥方面。研究發(fā)現(xiàn)MTHFD2作為轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的轉(zhuǎn)錄靶標，負責嘌呤的合成，可導致癌細胞的增殖[7]。MTHFD2蛋白在許多癌癥中表達水平均有顯著提高，并且與乳腺癌患者的低生存率相關(guān)[8]。Liu等[6]對乳腺癌患者組織切片進行蛋白印跡和免疫組化檢測，也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，認為這種蛋白質(zhì)可能是未來乳腺癌治療的獨立預后因素和潛在的治療靶點。劉新城等[9]報道肝癌組織中MTHFD2基因的表達水平顯著高于正常組織，且這種高表達與肝細胞癌轉(zhuǎn)移、復發(fā)有密切關(guān)系，由此預測MTHFD2基因可以作為預測肝癌患者預后的生物標志物。Hall等[10]發(fā)現(xiàn)MTHFD2基因編碼的酶參與甲硫氨酸循環(huán)相關(guān)的葉酸循環(huán)，甲硫氨酸循環(huán)又控制S-腺苷甲硫氨酸的量，人類胰島經(jīng)過棕櫚酯處理后改變了S-腺苷甲硫氨酸水平，從而導致全基因組甲基化和CpG島甲基化水平改變，故MTHFD2基因表達可能影響甲基供體的量。本研究的組織表達譜顯示，MTHFD2基因在腿肌中表達水平最高，而在肝臟中的表達水平最低，表達水平的差異可能與動物品種有關(guān)。

盡管本試驗對肉雞MTHFD2基因部分序列進行了克隆和組織表達譜研究，但其功能還不是太明確，與葉酸代謝途徑中的其他代謝酶相比，例如MTHFR，目前對于MTHFD2基因的研究主要集中在人類疾病方面，對畜禽的研究才剛剛開始，所以，MTHFD2基因在不同物種中的確切功能及其作用機制和差異也不清楚，需要進一步探討。