翟曉虎，徐傳芬，張玲玲，賀衛(wèi)華，馬 霞，楊俊花

(1江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300；2新泰市汶南鎮(zhèn)林業(yè)站，泰安 271200；3鄭州市城市園林科學(xué)研究所，鄭州 450000；4河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院，鄭州 450046；5上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，上海 201403)

豬細小病毒病是由豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)引起的一種母豬繁殖障礙性疾病，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為母豬不孕、流產(chǎn)、畸弱胎或死胎等，給我國及世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前，該病尚沒有特效治療手段，疫苗免疫仍是預(yù)防該病的首選方法。2004年，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院率先研制成功了PPV滅活疫苗，以預(yù)防豬的細小病毒病[1]。

Joo等[2]發(fā)現(xiàn)家兔可作為PPV疫苗效力檢驗的實驗動物，但豚鼠對PPV疫苗的血清學(xué)反應(yīng)與豬相似，特別是在免疫油佐劑PPV疫苗后效果確切[3-6]，因此，豚鼠是檢驗豬細小病毒病疫苗效力最理想的實驗動物。

蜂膠作為豬細小病毒滅活疫苗免疫佐劑的研究已有報道[7]，蜂膠黃酮(Propolis flavone，PF)是蜂膠的主要有效成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗感染、抗過敏和增加免疫等作用[8-9]。以蜂膠黃酮作為佐劑的減蛋綜合征(EDS-76)疫苗，免疫雛雞后，其血液中T淋巴細胞比例顯著增加，雛雞免疫力提高[10]。本試驗選取豚鼠作為豬細小病毒疫苗效檢動物，探討蜂膠黃酮作為豬細小病毒滅活疫苗佐劑對豚鼠體液免疫和細胞免疫的影響，以期為豬細小病毒滅活疫苗探尋更高效、安全的免疫佐劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

蜂膠購自禹州市凱旋藥業(yè)有限公司，經(jīng)鑒定為工蜂采集的植物樹脂與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的固體膠狀物。蜂膠黃酮(質(zhì)量濃度相當于原藥材1 g/mL)由河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院制藥工程學(xué)院中獸醫(yī)藥教研室制備，黃酮含量為85%。PPV-SD1疫苗株和PK-15細胞均由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院提供。ELISA試劑盒購自R&D Systems Inc.。

1.2 動物飼養(yǎng)管理

99只健康水平良好，體重(300±5) g的豚鼠，購自北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，PPV HI抗體效價呈陰性。飼養(yǎng)于標準的豚鼠籠中，每籠3只，每日早晨8：00定時飼喂，自由飲水，適應(yīng)期2周。

1.3 PPV抗原的制備

按細胞常規(guī)培養(yǎng)方法[11]培養(yǎng)PK-15細胞，12—15 h后按5%的接種量接種PPV病毒，約有80%的細胞發(fā)生病變時收集病毒。豚鼠紅細胞血凝試驗檢測血凝效價[12]30，同時檢測病毒含量變化[12]26。

將收集的病毒置于37 ℃條件下，0.3%甲醛作用24 h滅活，不斷攪拌。滅活病毒在PK-15細胞中連續(xù)傳代3次，觀察細胞病變以判斷病毒滅活是否完全。取滅活后的PPV用于制備蜂膠黃酮佐劑和油佐劑PPV疫苗。

1.4 蜂膠黃酮佐劑PPV疫苗的制備

在滅活后的PPV中按病毒液與蜂膠黃酮3∶1(v/v)的比例加入蜂膠黃酮，按總體積的0.005%加入10%硫柳汞溶液，在3 000 r/min下使用膠體磨攪拌3—5 min，充分混合。

1.5 油佐劑PPV疫苗的制備

先將94%的白油與6%的司本-80混合，加入2%的硬脂酸鋁，滅菌處理后用作油相；滅活后的PPV加入2%吐溫-80作為水相，按照油相與水相5∶3(v/v)混合，按總體積的0.005%加入10%硫柳汞溶液，在10 000 r/min下使用膠體磨攪拌20 min，充分混合乳化。

1.6 疫苗的檢驗

1.6.1 無菌檢驗及甲醛、硫柳汞含量測定

參照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(2000版)標準所述方法進行[13]。

1.6.2 安全檢驗

將24只豚鼠隨機平均分為3組，每組8只，第1組每只左腿肌肉注射0.5 mL蜂膠黃酮PPV疫苗，第2組每只左腿肌肉注射0.5 mL油佐劑PPV疫苗，第3組每只注射同等體積生理鹽水，每日觀察臨床癥狀，連續(xù)觀察21 d。

1.7 試驗設(shè)計

2015年9—11月，將經(jīng)疫苗檢驗合格的所有實驗動物隨機分為5組，每組15只，分別進行如下處理：(1)左腿肌肉注射0.5 mL蜂膠黃酮佐劑PPV滅活疫苗(PFA)；(2)肌肉注射油佐劑(OA)PPV滅活疫苗+口服1 mL蜂膠黃酮(終質(zhì)量濃度0.05 g/mL)(OA-PFApo)；(3)肌肉注射油佐劑(OA)PPV滅活疫苗+1 mL蜂膠黃酮(終質(zhì)量濃度0.05 g/mL)(OA-PFAim)；(4)肌肉注射油佐劑PPV 滅活疫苗0.5 mL(OA)；(5)左腿肌肉注射0.5mL生理鹽水作為空白對照，2周后相同劑量和給藥方式進行二次免疫。

分別于首次免疫后的第7天(D7)、第14天(D14)、第21天(D21)、第28天(D28)、第35天(D35)和第49天(D49)對5個試驗組每只豚鼠進行心臟采血，采血量0.5 mL。采用β-微量法測定各處理組血清中PPV HI抗體含量，于D7、D21、D35測定血清中IgG、IgM及細胞因子IFN-γ、IL-2含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS軟件進行Duncan多重分析，結(jié)果用“mean±SE”表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 疫苗的檢驗結(jié)果

無菌檢驗及甲醛、硫柳汞含量測定結(jié)果顯示：蜂膠黃酮佐劑和油佐劑PPV疫苗無菌檢驗均合格，甲醛、硫柳汞含量均符合規(guī)定。

安全檢驗結(jié)果顯示：觀察期內(nèi)，各組豚鼠存活率為100%，且均未出現(xiàn)局部和全身的不良反應(yīng)。

2.2 蜂膠黃酮對PPV疫苗HI抗體生成的影響

表1顯示，首免后D7，PFA、OA-PFApo、OA-PFAim組HI抗體效價均顯著高于OA組。首免后D14、D21，OA-PFAim組HI抗體效價顯著高于PFA和OA-PFApo組，后者顯著高于OA組。首免后D28，OA-PFAim組HI抗體效價顯著高于OA-PFApo組，后者顯著高于PFA和OA組。首免后D35、D42、D49，OA-PFAim組HI抗體效價均顯著高于PFA、OA-PFApo和OA組(表1)。

表1 HI抗體效價的動態(tài)變化

注：同列數(shù)據(jù)標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)；“-”表示HI抗體陰性

2.3 蜂膠黃酮對免疫PPV疫苗IgG生成的影響

首免后D7、D21、D35，PFA、OA-PFApo、OA-PFAim處理組血清IgG含量均顯著高于OA組，但PFA、OA-PFApo、OA-PFAim處理組間差異不顯著(圖1)。

2.4 蜂膠黃酮對免疫PPV疫苗IgM生成的影響

首免后D7、D21，PFA和OA-PFAim組血清IgM含量顯著高于OA-PFApo。OA-PFApo組顯著高于OA組。首免后D35，PFA、OA-PFApo、OA-PFAim、OA組間血清IgM含量差異不顯著(圖2)。

圖1 各組IgG的變化 Fig.1 Change of IgG level in serum of guinea pigs of different groups

圖2 各組IgM的變化 Fig.2 Change of IgM level in serum of guinea pigs of different groups

2.5 蜂膠黃酮對免疫PPV疫苗IFN-γ生成的影響

首免后D7、D21，PFA和OA-PFAim組血清IFN-γ含量顯著高于OA-PFApo，OA-PFApo組IFN-γ含量顯著高于OA組。首免后D35，各組血清IFN-γ含量差異不顯著(圖3)。

2.6 蜂膠黃酮對免疫PPV疫苗IL-2生成的影響

首免后D7、D21，PFA和OA-PFAim處理組的血清中IL-2水平顯著高于OA-PFApo。OA-PFApo處理組的血清IL-2水平顯著高于OA組。D35時，PFA和OA-PFAim組的血清IL-2水平顯著高于OA組(圖4)。

圖3 各組IFN-γ的變化Fig.3 Change of IFN-γ level in serum of guinea pigs of different groups

圖4 各組IL-2的變化Fig.4 Change of IL-2 level in serum of guinea pigs of different groups

3 討論

馬霞等[14]用家兔模型確定了納米蜂膠黃酮對豬細小病毒疫苗具有很好的佐劑活性，本試驗以豚鼠為動物模型再次驗證了蜂膠黃酮的佐劑活性，結(jié)果表明：與油佐劑組相比，蜂膠黃酮佐劑可以提高豚鼠的細胞免疫和早期體液免疫。免疫OAPPV疫苗同時肌注蜂膠黃酮可以顯著提高豚鼠的體液免疫和細胞免疫，免疫OAPPV疫苗同時口服蜂膠黃酮只可以顯著提高豚鼠的早期體液免疫。

將幾種蜂膠黃酮的疫苗佐劑使用途徑進行比較，結(jié)果表明：免疫OAPPV疫苗同時肌注蜂膠黃酮的方式最好，其次是蜂膠黃酮佐劑直接加到滅活PPV中制備疫苗，免疫OAPPV疫苗同時口服蜂膠黃酮的效果最差。由于油佐劑具有引起膿腫、致癌、佐劑性關(guān)節(jié)炎等不良反應(yīng)[15-16]，且從動物福利和動物性食品安全角度出發(fā)，也應(yīng)該尋找相應(yīng)的替代佐劑。蜂膠黃酮佐劑直接加到滅活PPV中制備疫苗的免疫效果在體液免疫特別是免疫早期顯著優(yōu)于油佐劑PPV疫苗，細胞免疫指標也顯著優(yōu)于油佐劑。因此，蜂膠黃酮可以作為一種安全的疫苗佐劑直接加入到滅活的PPV抗原中用于制備疫苗。

與油佐劑PPV疫苗相比，蜂膠黃酮佐劑PPV疫苗可以顯著提高血清中IFN-γ、IL-2等細胞因子的含量，增強疫苗細胞免疫效果；并能夠顯著提高血清免疫早期IgG、IgM含量，增強機體的體液免疫效果。沈志強等[17]將蜂膠作為禽霍亂疫苗佐劑，可以促進早期特異性抗體的產(chǎn)生。此外，趙恒章等[18]比較了油佐劑、蜂膠和鋁膠作為巴氏桿菌滅活苗的佐劑效果，顯示油佐劑滅活苗和蜂膠滅活苗的保護期相似，但應(yīng)用蜂膠佐劑滅活苗后，血清抗體水平上升速度比油佐劑苗快，且保護率較高。這種作用效果特點對免疫動物順利度過疫苗免疫后抗體產(chǎn)生的空檔期具有重要的意義。