趙孟 王玉婷 彭安林 戢漢斌○☆

精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制假說眾多，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，其中谷氨酸（glutamate，Glu）功能低下假說廣受臨床認(rèn)可[1-2]。N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid,NMDA）受體缺陷可以誘導(dǎo)Glu認(rèn)知系統(tǒng)功能紊亂，給予NMDA受體拮抗劑地卓西平馬來酸鹽（MK-801）可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生類似精神分裂癥的異常行為[3]。研究表明腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 （brain-derived neurtrophic factor，BDNF）、酪氨酸激酶受體 B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）功能異常與精神分裂癥中谷氨酸功能低下密切相關(guān)[1,4]。炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致海馬神經(jīng)元變性的重要因素，半乳糖凝集素3（Galectin-3）在神經(jīng)退行性疾病中表達(dá)上調(diào)可誘導(dǎo)神經(jīng)性炎癥進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元病變，加劇中樞神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展[5-6]。Galectin-3在精神分裂癥中表達(dá)情況及其參與調(diào)控海馬BDNF/TrkB信號(hào)通路情況鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究將采用MK-801建立Glu功能低下精神分裂癥大鼠模型，通過水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察大鼠認(rèn)知功能，并檢測(cè)海馬區(qū)Galectin-3、BDNF、TrkB蛋白及mRNA的水平，以探究Galectin-3在精神分裂癥大鼠海馬組織中的表達(dá)及可能對(duì)BDNF/TrkB調(diào)控的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠24只，體重（220±20）g，購買于華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：NO.42009800001823。于室溫、常規(guī)環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將所有大鼠按照取出順序依次編為1～24號(hào)，單號(hào)為對(duì)照組（C組），雙號(hào)為模型組（M組），每組12只。M組大鼠連續(xù)1周每日腹腔注射0.5 mg/kg MK-801（購自Sigma，貨號(hào)：121917），建立精神分裂癥大鼠模型[3,7]，C組注射等量生理鹽水作為對(duì)照。

1.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)M組末次給藥后30 min對(duì)各組大鼠進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)[3,8]，以評(píng)價(jià)精神分裂癥模型。

1.2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 抓住大鼠尾部提起將其放入5×5的 25格紙箱（100 cm×100 cm）中，觀察 3 min內(nèi)大鼠水平穿越格數(shù)（四爪均進(jìn)入一個(gè)格子），每只大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束清洗實(shí)驗(yàn)箱以便下一次評(píng)估。

1.2.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 將大鼠置于一個(gè)透明容器內(nèi)（高度為60 cm，直徑為25 cm），保持水位在30 cm，水溫（25±2）℃，記錄大鼠5 min內(nèi)游泳不動(dòng)時(shí)間。不動(dòng)時(shí)間定義為大鼠在水上漂浮沒有四肢掙扎，頭部露在水面以上，僅偶爾移動(dòng)。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估大鼠認(rèn)知功能。水迷宮水池（直徑160 cm，高50 cm）內(nèi)水深25 cm，水溫（20±2）℃。將水池等分劃分4個(gè)象限，在第1象限內(nèi)距離池壁35 cm處有1個(gè)直徑12 cm、高22 cm的圓形黑色平臺(tái)，位于水下3 cm。于第3象限將大鼠放入游泳池中，水迷宮上方連接的攝像機(jī)等系統(tǒng)（儀器型號(hào)：XR-XM101，上海欣軟信息科技有限公司）可在電腦上同步顯示并記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡。建模時(shí)，每天訓(xùn)練2次，定位航行訓(xùn)練7 d，第8 d進(jìn)行探針實(shí)驗(yàn)，即移除平臺(tái)，觀察大鼠逃避潛伏期和在靶象限穿越平臺(tái)次數(shù)。大鼠放入水中直至到達(dá)終點(diǎn)平臺(tái)的時(shí)間記錄為逃避潛伏期，此期間穿過第1象限平臺(tái)上方的次數(shù)為穿越平臺(tái)次數(shù)。

1.4 免疫組化法檢測(cè)大鼠腦組織海馬Galectin-3和BDNF表達(dá)水迷宮探針實(shí)驗(yàn)后，用過量水合氯醛（1 g/kg）深度麻醉處死大鼠，斷頭冰下解剖大腦取腦組織。每組取6只大鼠腦組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，行石蠟包埋常規(guī)切片，于海馬吻合位置連續(xù)冠狀切片 （厚度 4 μm）。采用免疫組化法檢測(cè)Galectin-3和BDNF表達(dá)：二甲苯、酒精處理脫蠟后，檸檬酸鹽抗原修復(fù)1 h，H2O2孵育10 min，血清封閉 20 min，Galectin-3（1:500，Abcam）、BDNF（1:1000，Abcam）一抗4℃孵育過夜，洗脫孵育相應(yīng)二抗（武漢安特捷有限公司），DAB顯色15 min后封片，顯微鏡（DM2700，Leica，Germany）下觀察腦組織海馬區(qū)域Galectin-3和BDNF陽性表達(dá)情況。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)大鼠海馬Galectin-3、BDNF和TrkB蛋白表達(dá)冰下解剖剩余未行固定包埋的大鼠腦組織（n=6），取海馬組織，以1:10的比例采用1%的苯甲磺酰氟（PMSF）裂解液進(jìn)行勻漿提取蛋白樣品，4℃下 10000×g離心 10 min后取上清，BCA試劑盒（武漢拜意爾公司）測(cè)定蛋白含量并調(diào)節(jié)蛋白濃度至相同，加入5×上樣緩沖液沸水浴 10 min，-80℃保存?zhèn)溆?。?20 μL 樣品上樣，通過10%SDS-P聚丙酰胺凝膠電泳（SDS-聚丙烯酰胺試劑盒，武漢拜意爾公司）分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉。分別加入Galectin-3、BDNF、TrkB和GAPDH抗體（1:3000，武漢安特捷有限公司）4℃孵育過夜，次日加入二抗室溫孵育后，ECL法曝光顯影獲得蛋白條帶，觀察大鼠海馬Galectin-3、BDNF和TrkB蛋白表達(dá)。

1.6 RT-PCR檢測(cè)大鼠海馬組織Gelectin-3、BDNF和TrkB mRNA水平上述冰下解剖的大鼠腦組織（n=6），稱取海馬組織 40 mg，利用 TRIzol法提取總RNA，然后將1 μg總RNA通過cDNA Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RT-PCR在LightCycler@480（Roche公司）設(shè)備中進(jìn)行，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并以GAPDH作為內(nèi)參測(cè)定Gelectin-3、BDNF和TrkB mRNA水平。引物序列均由武漢拜意爾公司提供，見表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)熱10 min，94℃變性 10 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 30 s，循環(huán)25次。定量PCR特異產(chǎn)物通過溶解曲線分析，以2-ΔΔCT表示相對(duì)基因表達(dá)變化。

表1RT-PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。行為學(xué)和水迷宮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、Gelectin-3、BDNF和TrkB蛋白及mRNA檢測(cè)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，組間差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)與水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果建模1周，M組大鼠水平穿越格數(shù)和C組比較減少（t=-9.319，P＜0.001），而游泳不動(dòng)時(shí)間延長（t=6.948，P＜0.001）。兩組大鼠經(jīng)歷同樣次數(shù)的水迷宮訓(xùn)練后，M組逃避潛伏期時(shí)間高于 C 組（t=6.625，P＜0.001），穿越平臺(tái)次數(shù)低于 C 組（t=-6.597，P＜0.001），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 大鼠海馬組織免疫組化結(jié)果M組和C組海馬區(qū)Galectin-3含量百分比分別為6.58%±0.71%和 1.71%±0.41%，M 組高于 C 組 （t=10.198，P=0.001）。M組和C組大鼠腦組織海馬區(qū)域BDNF含量百分比為 0.92%±0.15%和 4.83%±0.41%，M組低于 C 組（t=-15.412，P＜0.001）。 見圖 1。

2.3 大鼠海馬組織Galectin-3、BDNF和TrkB蛋白含量及mRNA水平與C組相比，M組海馬區(qū)Galectin-3 蛋白（t=13.211，P＜0.001）及 mRNA 水平（t=5.820，P=0.004）增加，而 BDNF 及 TrkB 蛋白與mRNA的表達(dá)量下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2與表3。

圖1 大鼠海馬區(qū)Galectin-3和BDNF表達(dá)免疫組化結(jié)果（×200）

圖2 大鼠腦組織海馬區(qū)Galectin-3、BDNF和TrkB蛋白含量電泳圖

3 討論

早期研究表明，阻斷NMDA受體可導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)類似精神分裂癥的表現(xiàn)，如認(rèn)知缺陷、行為紊亂等[9]。本研究采用MK-801阻斷NMDA受體建立精神分裂癥模型，通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)如曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)估M組大鼠活動(dòng)狀態(tài)。和C組比較，M組大鼠自主活動(dòng)量明顯減少，游泳不動(dòng)時(shí)間顯著延長，說明MK-801干預(yù)后動(dòng)物精神分裂癥模型造模成功，這和于文娟等[3]、蔡菡等[8]的研究結(jié)果一致。此外，行為學(xué)水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示M組大鼠逃避潛伏期時(shí)間較C組明顯延長，穿越平臺(tái)次數(shù)也顯著減少，這一結(jié)果表明MK-801能造成大鼠認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶能力下降，與占瑾瓊等[2]、房茂勝等[7]的報(bào)道相符。

精神分裂癥大鼠自主活動(dòng)減少，認(rèn)知、學(xué)習(xí)障礙與中樞神經(jīng)系統(tǒng)海馬神經(jīng)元變性密切相關(guān)。既往研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致海馬神經(jīng)元變性的重要因素之一[10]。Galectin-3是半乳糖凝集素家族的致炎因子，在巨噬細(xì)胞活化、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用[11-12]。Galectin-3可與腦組織海馬區(qū)的β-半乳糖異性結(jié)合形成β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ），應(yīng)激狀態(tài)下 Aβ 遭受炎性因子侵襲變性沉積，進(jìn)而粘附于神經(jīng)元軸索、樹突及膠質(zhì)細(xì)胞等，將加劇海馬神經(jīng)元變性[13]。本研究結(jié)果證實(shí)，與C組比較，M組大鼠海馬區(qū)Galectin-3蛋白含量及mRNA水平顯著上調(diào)。Galectin-3高表達(dá)會(huì)加劇大鼠海馬區(qū)的炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)炎癥因子大量釋放，同時(shí)Aβ過度沉積，誘導(dǎo)神經(jīng)元軸索、樹突及膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生變性，突觸傳遞異常。膠質(zhì)細(xì)胞表面的神經(jīng)元釋放谷氨酸減少，突觸傳遞效能下降，會(huì)導(dǎo)致BDNF/TrkB功能紊亂[14]。本研究結(jié)果提示，M組大鼠海馬區(qū)域BDNF、TrkB蛋白含量及mRNA水平和C組比較顯著降低，說明精神分裂癥大鼠海馬組織中BDNF/TrkB信號(hào)通路調(diào)節(jié)紊亂，這與WANG等[15]的研究結(jié)果相同，BDNF/TrkB功能異常加劇了海馬區(qū)神經(jīng)元病變，最終導(dǎo)致M組大鼠認(rèn)知功能缺陷。

本研究給予MK-801阻斷NMDA受體后，大鼠自主活動(dòng)減少，學(xué)習(xí)能力變差，認(rèn)知功能顯著降低，并發(fā)現(xiàn)其海馬組織中的致炎因子Galectin-3呈高表達(dá)，且BDNF/TrkB功能異常同步發(fā)生。精神分裂癥大鼠BDNF/TrkB功能異常、海馬神經(jīng)元損傷可能與海馬組織中Galectin-3過度表達(dá)有關(guān)。本研究不足之處在于缺乏干預(yù)組，Galectin-3在精神分裂癥中是誘導(dǎo)BDNF/TrkB功能下調(diào)的原因，還是一種結(jié)果尚不清楚，因此Galectin-3在海馬神經(jīng)元損傷中的具體機(jī)制有待后續(xù)研究進(jìn)一步探究。

表3 大鼠海馬區(qū)Galectin-3、BDNF和TrkB蛋白及mRNA表達(dá)情況