陳建玲 傅迎美 禹順英 王艷玲

孤獨(dú)癥譜系障礙（autism spectrum disorders，ASD）臨床表現(xiàn)為兩大主要癥狀：社會(huì)交流和互動(dòng)方面持續(xù)的缺陷和局限，重復(fù)的行為、興趣或活動(dòng)模式[1]。最新數(shù)據(jù)顯示，美國(guó)孤獨(dú)癥譜系障礙的患病率正在增加[2]。根據(jù)孤獨(dú)癥和發(fā)育殘疾監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)（Autism&Developmental Disabilities Monitoring，ADDM）的數(shù)據(jù)，2014年兒童中孤獨(dú)癥譜系障礙的患病率為16.8/1000，是2000年ADDM監(jiān)測(cè)結(jié)果的2倍多[2-3]。目前ASD的診斷主要依據(jù)癥狀，缺乏可靠的生物學(xué)診斷指標(biāo)，也無特效的治療手段[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，糖類及脂質(zhì)代謝異常可能參與孤獨(dú)癥的發(fā)病[5]。近年有研究顯示ASD患者血漿中脂肪酸合成酶 （fatty acid synthase，F(xiàn)AS）表達(dá)增加[6]。本課題組前期研究還發(fā)現(xiàn)，孤獨(dú)癥模型大鼠前額葉大腦皮質(zhì)和小腦組織中FAS和乙酰輔酶 A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）表達(dá)增加[7]。孤獨(dú)癥患者腦組織中是否也存在FAS、ACC等脂肪酸代謝酶的表達(dá)異常，目前尚缺乏研究。為此，本研究擬探討脂肪酸代謝酶系在ASD腦組織中的表達(dá)特點(diǎn)及意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象ASD組兒童的腦組織購(gòu)自發(fā)育障礙患者腦和組織庫(kù)（Brain and Tissue Bank for Developmental Disorders，BTBDD）。ASD 組入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合 《美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition，DSM-Ⅳ）孤獨(dú)癥診斷標(biāo)準(zhǔn)并由專科醫(yī)生確診；②年齡3～15歲；③性別不限；④死后間隔時(shí)間0～24 h；⑤生前無抗精神病藥用藥史；⑥除外腦部疾病和外傷的突然死亡；⑦腦組織為新鮮冰凍組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在脆性X綜合征或其他廣泛發(fā)育障礙者；②患有強(qiáng)迫癥、情感障礙或其他精神障礙者；③合并神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病、腦外傷或腦血管病者。ASD組共入組8例。所有組織均由組織庫(kù)獲得家屬知情同意用于研究。

對(duì)照組兒童的腦組織購(gòu)自美國(guó)國(guó)家兒童保健和人類發(fā)育研究所（National Institute of Child Health and Human Development，NICHD）。 對(duì)照組入組標(biāo)準(zhǔn)：①生前無精神疾?。虎谀挲g3～15歲；③性別不限；④死后間隔時(shí)間0～24 h；⑤生前無抗精神病藥用藥史；⑥除外腦部疾病和外傷的突然死亡；⑦腦組織為新鮮冰凍組織。對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)：同患者組。對(duì)照組共入組8例。所有組織均由組織庫(kù)獲得家屬知情同意用于研究。

1.2 研究方法

1.2.1 腦組織勻漿制備 所有樣本取前額葉大腦皮質(zhì)。首先制備組織勻漿緩沖液，成分為50 mmol/L Tris-HCl（pH 為 7.4），8.5%蔗糖，2 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），10 mmol/L β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol），以及蛋白酶抑制劑 cocktail（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）； 勻漿緩沖液冰上預(yù)冷；然后將購(gòu)買的新鮮冰凍前額葉皮質(zhì)腦組織分別按體積與質(zhì)量百分比（10%V/W）加入預(yù)冷的組織勻漿液，4℃充分勻漿1 min，直至溶液無肉眼可見的沉淀；最后將勻漿液分裝至EP管中，備用。

1.2.2 脂肪酸代謝酶表達(dá)檢測(cè) 采用蛋白質(zhì)印跡法（western blotting）檢測(cè)前額葉皮質(zhì)中脂肪酸代謝酶表達(dá)水平。先用BCA法檢測(cè)蛋白濃度 （采用Thermo Scientific公司的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒），再根據(jù)蛋白質(zhì)樣品濃度，用Laemmli蛋白上樣緩沖液及腦組織勻漿緩沖液制備腦組織蛋白樣品，經(jīng)凝膠電泳轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜。然后室溫封閉 1 h，4℃過夜孵育一抗 （Cell Signaling Technology，USA）（1:1000）：FAS（C20G5）兔單克隆抗體（#3180）、ACC （C83B10）兔單克隆抗體（#3676）、AceCS1 （D19C6） 兔單克隆抗體（#3658）、ACSL1（D2H5）兔單克隆抗體（#9189）、β-actin 兔單克隆抗體（#8457S）。室溫下孵育二抗——HRP標(biāo)記羊抗兔 IgG（Cell Signaling Technology，USA）（1:2000）（#7074）1 h，暗室中顯影鑒定。 以 β-actin兔單克隆抗體 （Cell Signaling Technology，USA）（#8457S）作為參照。所得圖像經(jīng)掃描儀記入電腦，用Image J軟件（NIH，美國(guó)）分析目標(biāo)條帶的灰度值，以灰度值比值 （目標(biāo)條帶的灰度值/β-actin的灰度值）反映各種蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用IBM SPSS Statistics 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間年齡、死后間隔時(shí)間及脂肪酸代謝酶表達(dá)水平比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，性別比較采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 基本資料ASD組年齡 4～14歲，平均（9.12±3.39）歲，男 5例、女 3例，死后間隔時(shí)間 9～24 h，平均（15.12±4.79）h。對(duì)照組年齡 4～14 歲，平均（8.37±3.73）歲，男 5 例、女 3 例，死后間隔時(shí)間10～21 h，平均（16.75±3.41）h。兩組年齡、性別構(gòu)成、死后間隔時(shí)間等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。組織標(biāo)本供者的基本資料見表1。

2.2 前額葉大腦皮質(zhì)ACC表達(dá)水平孤獨(dú)癥組ACC灰度值比值為 1.09±0.24，對(duì)照組為 0.92±0.11。孤獨(dú)癥組比對(duì)照組略高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.81，P=0.10）。 見圖 1。

2.3 前額葉大腦皮質(zhì)FAS表達(dá)水平孤獨(dú)癥組FAS的灰度值比值為0.61±0.70，對(duì)照組為0.49±0.10。兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=-2.82，P=0.01），孤獨(dú)癥組高于對(duì)照組。見圖1。

2.4 前額葉大腦皮質(zhì)AceCS1表達(dá)水平孤獨(dú)癥組AceCS1的灰度值比值為 0.77±0.07，對(duì)照組為0.72±0.05。兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.79，P=0.09）。 見圖 1。

2.5 前額葉大腦皮質(zhì)ACSL1表達(dá)水平孤獨(dú)癥組ACSL1的灰度值比值為 0.85±0.13，對(duì)照組為0.69±0.11。孤獨(dú)癥組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.75，P=0.02），孤獨(dú)癥組 ACSL1 蛋白表達(dá)水平是對(duì)照組的1.24倍。見圖1。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)孤獨(dú)癥患兒前額葉大腦皮質(zhì)中ACSL1和FAS的表達(dá)明顯增加。FAS在脂肪酸合成中起關(guān)鍵作用，催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A生成長(zhǎng)鏈脂肪酸[8]。ACSL1在脂肪酸碳鏈的延長(zhǎng)過程中發(fā)揮重要作用[9]。ACSL1和FAS的表達(dá)增加提示孤獨(dú)癥前額葉大腦皮質(zhì)中可能存在脂肪酸合成增加。

圖1 脂肪酸代謝酶系在孤獨(dú)癥和對(duì)照組前額葉大腦皮質(zhì)中的表達(dá)情況。孤獨(dú)癥組FAS和ACSL1的蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組 （均P＜0.05），ACC和AceCS1的表達(dá)兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）

表1研究對(duì)象基本信息

本研究結(jié)果與既往文獻(xiàn)類似，ZAKAREIA等[6]發(fā)現(xiàn)孤獨(dú)癥患者血漿中也存在FAS表達(dá)增加，且FAS的表達(dá)水平與孤獨(dú)癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系。此外，本課題組前期的動(dòng)物模型研究也發(fā)現(xiàn)孤獨(dú)癥前額葉大腦皮質(zhì)及小腦組織中FAS、ACC表達(dá)增加[7]。與動(dòng)物模型研究結(jié)果不同的是，本研究未發(fā)現(xiàn)孤獨(dú)癥前額葉大腦皮質(zhì)中存在ACC表達(dá)增加，而存在ACSL1的表達(dá)增加，提示人類孤獨(dú)癥前額葉大腦皮質(zhì)可能在脂肪酸合成過程中碳鏈延長(zhǎng)較為活躍。MEWS等[10]研究發(fā)現(xiàn)AceCS在維持哺乳動(dòng)物海馬區(qū)神經(jīng)元功能及改善記憶方面有顯著作用。本研究未發(fā)現(xiàn)AceCS1在孤獨(dú)癥組前額葉大腦皮質(zhì)與對(duì)照組有差異，提示AceCS可能在哺乳動(dòng)物不同腦區(qū)中功能不同，或者AceCS可能存在多種亞型。

脂肪酸分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，目前已有研究表明omega-3多不飽和脂肪酸不足可能可引起前腦無裂畸形及胼胝體發(fā)育障礙[11-12]。而胼胝體發(fā)育障礙的小鼠在行為學(xué)上又表現(xiàn)出類似于人類孤獨(dú)癥的核心癥狀[13]。此外，給伴有ASD癥狀的早產(chǎn)兒補(bǔ)充omega-3和omega-6多不飽和脂肪酸可以部分改善患兒的社交技能缺陷[14]。這些研究表明，脂肪酸異?？赡軈⑴c孤獨(dú)癥的發(fā)病。本研究也發(fā)現(xiàn)孤獨(dú)癥患兒可能存在前額葉大腦皮層中脂肪酸合成功能增強(qiáng)。而脂肪酸含量的多少受到脂肪酸分解和合成代謝的影響，因而脂肪酸合成功能增強(qiáng)與患者腦內(nèi)脂肪酸構(gòu)成及含量變化之間的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

因此，以脂肪酸合成相關(guān)通路為出發(fā)點(diǎn)，來探索孤獨(dú)癥的發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)，具有理論和現(xiàn)實(shí)意義。然而，本研究只是在尸腦中的初步探索，具體功能還需要進(jìn)一步的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)論證。