王 黎 秦桂芳 柯 鴻 魏廣民

（1.湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院，湖北 十堰442000）

急性早幼粒細胞白血病（APL）在急性白血病中惡性程度較高，是一種外周血及骨髓中早幼粒細胞異常增多的造血組織惡性疾?。?-2］。急性早幼粒細胞白血病在急性髓系白血病中被分為M3型，其發(fā)病以35歲左右的年輕人居多，其主要病理特點是正常血細胞的制造被明顯抑制，而骨髓及其他造血組織中白血病細胞無限制地大量增生并進入外周血液而致病［3-4］。內(nèi)臟嚴重出血是導致急性早幼粒細胞白血病患者早期死亡的主要原因，其出血的原因包括抗凝及纖溶系統(tǒng)激活、凝血異常、血小板功能障礙及血管內(nèi)皮損傷等［5-6］。目前，隨著本病病理機制研究的深入，針對腫瘤特異性標志分子并應用誘導分化治療，急性早幼粒細胞白血病已經(jīng)從最兇險的白血病變成治愈率最高的白血?。?-8］。但患者因多種因素導致止、凝血異常，極易誘發(fā)彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC），使病情更為兇險，因此，研究引起內(nèi)臟出血并進行有效治療仍有一定的臨床意義［9］。雷公藤紅素是從雷公藤根皮中提取出的一種五環(huán)三萜類化合物，具有抗炎、免疫抑制、抗纖維化、抗腫瘤血管生成等作用，在抗白血病方面也越來越受到重視［10-11］。目前對雷公藤紅素抗癌和治療風濕等方面的研究比較深入，但對急性早幼粒細胞白血病導致凝血功能異常方面卻缺乏相應的研究，為糾正急性早幼粒細胞白血病止凝血功能異常，預防或治療已出現(xiàn)的DIC現(xiàn)象，本研究觀察和分析了雷公藤紅素對人急性早幼粒細胞白血病重度聯(lián)合免疫缺陷（SCID）小鼠移植瘤模型凝血功能的影響，為臨床可能用于輔助治療提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SCID beige小鼠30只，雌雄各半，3～5周齡，體質(zhì)量16.5～17.5 g，小鼠由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK2016-0031飼養(yǎng)于十堰市人民醫(yī)院科技中心，在本中心標準實驗室開展實驗研究。動物飼養(yǎng)在層流架內(nèi)無菌獨立送風隔離IVC籠中，與鼠接觸的一切物品、飼料和飲用水均須滅菌處理。實驗中遵偱3R原則，給予SCID beige小鼠人道關(guān)懷，保證實驗動物的福利。實驗期間動物自由飲用滅菌雙蒸水，飼以加有維生素C和雞蛋的標準顆粒飼料，12 h交替光照，環(huán)境溫度控制在22～24℃，相對濕度50%～75%。

1.2 試藥與儀器 雷公藤紅素標準品 （上海源葉生物，批號：34157-83-0）；人急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4由十堰市人民醫(yī)院科技中心凍存保種；胎牛血清和RPMI 1640（美國Gibco公司）；全自動血液分析儀由雷度米特醫(yī)療設備（上海）有限公司提供；C2000-A全自動凝血分析儀由北京普利生儀器有限公司提供。

1.3 分組與造模 30只小鼠隨機取10只不造模，為對照組。另外20只制作模型。人急性早幼粒細胞白血病SCID小鼠移植瘤模型建立：先將凍存保種的人急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4取出，于37℃條件下解凍后接種于含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，移入飽和濕度、恒溫37℃并通5%CO2的隔離培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和傳代。然后待NB4細胞生長成熟后調(diào)至按5×106/mL的細胞溶液備用。接種時取20只SCID beige小鼠，采用尾靜脈注射對數(shù)生長期的NB4細胞5×106個/只的方法建立人急性早幼粒細胞白血病SCID小鼠移植瘤模型［12］。將上述接種NB4細胞的20只SCID beige小鼠隨機均分為模型組和實驗組，每組10只。

1.4 干預方法 造模3周后實驗組腹腔注射1%雷公藤紅素0.1 mL/鼠治療14 d，對照組和模型組腹腔注射等劑量0.9%氯化鈉注射液作為陰性和陽性對照。

1.5 觀察指標 凝血功能實驗，在治療前后每組取5只小鼠，剝除眼球，然后吸取眼底靜脈血0.1 mL進行凝血功能實驗。實驗時采用雙磁路磁珠凝固法觀察小鼠凝血時間（CT）、采用斷尾法觀察出血時間（BT）［13］。凝血因子生成實驗，參照文獻［14］，采用凝血因子生成實驗檢測小鼠眼底靜脈血內(nèi)/外源性凝血因子Ⅹa。檢測時準確吸取備用眼底靜脈血100 μL加入含有130 nmol/L因子Ⅹ、5 nmol/L因子Ⅷ、1 nmol/L因子Ⅸa、5 mmol/L CaCl2和0.2 nmol/L凝血酶 （Ⅱa）的緩沖液中，37℃孵育，10 min后用7 mmoL/L的絡合劑EDTA終止反應。加入0.8 mmol/L的顯色底物，待反應中止后迅速上機，將酶標儀波長調(diào)至405 nm，讀取內(nèi)/外源性凝血因子Ⅹa的生成量。將取上述全血105個全血細胞與含5 mmol/L CaCl2、130 nmol/L因子Ⅹ和1 nmol/L因子Ⅶa的緩沖液中共孵育 10 min，用7 mmol/L的EDTA終止，然后加入0.8 mmol/L的顯色底物測定外源性因子生成量。將105個全血細胞加入含 5 mmol/L CaCl2、1 nmol/L 因子Ⅴa、0.05 nmol/L 因子Ⅹa、1 nmol/L凝血酶原的緩沖液中共孵育10 min，用7 mmol/L的EDTA終止；加入0.8 mmol/L的S2238，用酶標儀在405 nm波長處測定凝血酶生成量。采用免疫滲濾膠體金顯色反應法檢測血清D-二聚體 （D-D）含量。采用瑞氏染色后顯微鏡下肉眼計數(shù)眼底靜脈血白細胞計數(shù)和人早幼粒細胞陽性率。觀察模型和實驗組動物2個月生存時間。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，多組間均數(shù)檢驗先進行采用多因素方差分析，符合正態(tài)分布的組間兩兩比較采用t檢驗，不符合正態(tài)分布的組間兩兩比較采用校正LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠治療前后外周血凝血功能指標比較 見表1。對照組治療前后凝血功能指標比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。模型組和實驗組治療前凝血功能指標比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。模型組治療后外周血凝血指標中CT、BT和APTT均較治療前降低、DD、FIB 和內(nèi)/外源性凝血因子Ⅹa升高 （P＜0.05）；而實驗組治療后 CT、BT和 APTT均延長（P＜0.05），DD、FIB和內(nèi)/外源性凝血因子Ⅹa降低（P＜0.05），與模型組和治療前比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 各組小鼠治療前后外周血白細胞計數(shù)、人早幼粒細胞陽性率及生存時間比較 見表2。模型組和實驗組治療前外周血均出現(xiàn)白細胞計數(shù)和人早幼粒細胞陽性率，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。治療前模型組和實驗組小鼠外周血白細胞計數(shù)和人早幼粒細胞陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療后模型組小鼠外周血白細胞計數(shù)和人早幼粒細胞陽性率較治療前進一步升高，與治療前和對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗組治療后明顯降低，但均未至對照組水平，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗組治療后與模型組同時期和治療前比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。經(jīng)2個月生存時間觀察，對照組無動物死亡，實驗組平均生存時間為（49.48±6.14）d，明顯高于模型組平均生存時間為（32.67±4.27）d，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 各組小鼠治療前后外周血凝血功能指標比較（x±s）

表2 各組小鼠治療前后外周血白細胞計數(shù)、人早幼粒細胞陽性率及生存時間比較（x±s）

3 討 論

流行病學顯示，臨床上急性早幼粒細胞白血病并不少見，占同期急性白血病的18.7%左右，發(fā)病率比西方國家高10%，發(fā)病年齡中位數(shù)為30～38歲，10歲以下者較罕見［15］。急性早幼粒細胞白血病具有以下特點：病理學檢測可見異常顆粒充滿早幼粒細胞質(zhì)內(nèi)；出血傾向嚴重，出血的發(fā)生率高達72%～94%，誘發(fā)的彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC）是其主要死亡因素；高達90%的患者出現(xiàn) t（15；17）（q22；q12）等特異性染色體改變；患者雖對化療敏感，但早期死亡率偏高，10%～20%患者死于時期出血或DIC；三氧化二砷能誘導早幼粒細胞凋亡、維A酸能誘導其細胞分化成熟；隨著對早幼粒細胞生物學的特性認識的不斷提高及針對性治療方法的改進，經(jīng)治療后病情持續(xù)緩解時間長，預后明顯改善，早期因出血或DIC引起的死亡明顯減少，死亡率明顯下降［16］。急性早幼粒細胞白血病的病因復雜，有研究證實，早幼粒細胞質(zhì)內(nèi)存在大量的纖溶物質(zhì)t-PA、u-PA和高活性促凝物質(zhì)如CP、TF等，也存在大量蛋白水解酶如胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶等，隨著白血病細胞被化療破壞或增殖分化后，這類蛋白水解酶、纖溶活性及促凝物質(zhì)大量釋放入循環(huán)系統(tǒng)中，引起纖維蛋白溶解和DIC，患者因止、凝血功能異常，進而引起全身出血傾向或DIC現(xiàn)象［17-18］。由此可見，止、凝血異常誘發(fā)的出血傾向或DIC是急性早幼粒細胞白血病的主要死因。糾正止、凝血功能異常是防治出血傾向或DIC，挽救患者生命的重要環(huán)節(jié)。

雷公藤紅素主要來源于衛(wèi)矛科植物雷公藤的根皮，又稱南蛇藤素，是一類具有很強的抗類風濕、抗氧化和抗癌癥新生血管生成等多種生物學活性的生物堿，是治療類風濕病中藥制劑雷公藤多苷片、雷公藤片的有效成分之一［19］。多項研究表明，雷公藤紅素的主要活性與藥理作用有細胞毒活性、免疫調(diào)節(jié)、免疫抑制、抗炎、抗過氧化等作用［20］。雷公藤紅素也是一種有效的蛋白酶體抑制劑，可通過抑制蛋白酶體活性進而誘發(fā)癌細胞凋亡、白血病化療藥物降低毒副作用并增強其敏感性［21］。

目前針對其對人急性早幼粒細胞白血病凝血功能的研究還屬空白。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素可糾正SCID小鼠移植瘤小鼠止、凝血異常現(xiàn)象。如實驗組治療后外周血白細胞計數(shù)和人早幼粒細胞陽性率較治療前和模型組降低、生存時間延長；凝血指標中CT、BT和APTT均延長，且DD、FIB和內(nèi)/外源性凝血因子Ⅹa均降低。

在凝血過程中，機體存在內(nèi)/外源性凝血途徑。在外源性凝血途徑中，參加的凝血因子并非全部存在于血液中，還有外來的凝血因子參與止血。組織因子是存在于多種細胞質(zhì)膜中的一種特異性跨膜蛋白，當組織損傷后，組織因子釋放，鈣離子與因子Ⅶ形成1∶1的復合物，因子Ⅹ被激活，接著凝血酶激活血小板，催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，產(chǎn)生凝血作用，從而啟動外源性凝血，而臨床上常以凝血酶原時間測定來反映外源性凝血途徑的狀況［22-23］。而內(nèi)源性凝血途徑是指參與凝血的因子全部來自血液，通常因血液與帶負電荷的異物表面接觸而啟動。當血液與帶負電荷的異物表面接觸時，首先是FⅫ結(jié)合到異物表面，并被激活為FⅫa。FⅫa的主要功能是激活FⅪ成為FⅪa，從而啟動內(nèi)源性凝血途徑。外源凝血途徑和內(nèi)源凝血途徑可以相互活化，兩者可能在急性早幼粒細胞白血病的病理進程中啟動止凝血一系列連鎖反應，在因子Ⅹ處匯合，引起凝血酶原激活及纖維蛋白的形成，從而引起出血或DIC的形成。雷公藤紅素可能作用于這一環(huán)節(jié)，抑制引起內(nèi)/外源性凝血途徑的凝血因子DD、FIB和內(nèi)/外源性凝血因子Ⅹa，干擾內(nèi)/外源性凝血途徑，而糾正急性早幼粒細胞白血病止、凝血功能障礙并防止DIC的發(fā)生。這也是SCID小鼠移植瘤小鼠在治療后外周血白細胞計數(shù)和人早幼粒細胞陽性率較治療前和模型組降低、生存時間延長的主因。

正常生理狀態(tài)下，纖溶酶和抑制酶維持于動態(tài)平衡，而病理狀態(tài)下，如組織損傷時機體發(fā)生凝血時，凝血酶作用于纖維蛋白使之轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)纖維蛋白，同時激活纖溶系統(tǒng)，纖溶系統(tǒng)激活后會降解纖維蛋白，形成各種碎片。r鏈能把2個含D片段的碎片連接起來形成DD。由此可見，DD水平的上升代表凝血機制被激活、凝血塊在血液循環(huán)中形成。因此，DD升高可反映體內(nèi)存在著凝血及纖溶活性增強，是凝血功能的重要分子標志物，也是急性白血病預后的重要標志物［24］。有臨床報道雷公藤可降低早期糖尿病腎病患者血清DD水平［25］。這說明雷公藤對血清DD有一定的影響，但目前沒有文獻顯示雷公藤可降低急性早幼粒細胞白血病血清DD。而本研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可降低人急性早幼粒細胞白血病模型小鼠血清DD。但目前沒有文獻顯示雷公藤紅素可降低急性早幼粒細胞白血病患者血清DD，這可能是雷公藤紅素影響凝血功能的新靶點。下一步將重點研究雷公藤紅素對人急性早幼粒細胞白血病患者血清DD等與凝血功能相關(guān)的其他因子是否產(chǎn)生影響。