朱 清 姚蓓蓓 吳明華

（南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 210029）

腦缺血性腦血管病是嚴重威脅人類健康的常見病及多發(fā)病，伴隨著腦組織快速的缺血缺氧，大量的神經(jīng)元壞死，導致神經(jīng)系統(tǒng)不可逆的損傷，而神經(jīng)再生是腦缺血后神經(jīng)功能恢復的關鍵。生長相關蛋白43（GAP-43）主要表達于發(fā)育或再生軸突的生長錐末端，與神經(jīng)發(fā)育、軸突再生、突觸重建密切相關，是神經(jīng)突起生長與再生的標記。β微管蛋白Ⅲ（β-TubulinⅢ）是神經(jīng)細胞的特異性微管蛋白，也是細胞骨架家族成員之一，被認為是神經(jīng)元發(fā)育的標志［1］。因此這兩種蛋白均可反映腦缺血后內源性神經(jīng)再生情況。

蒲參膠囊是由第四軍醫(yī)大學藥物研究所研制的復方中成藥，由何首烏、蒲黃、丹參、川芎、赤芍、山楂、澤瀉、黨參8味藥物組成。本實驗通過觀察蒲參膠囊對大鼠腦缺血/再灌注后梗死區(qū)周邊組織GAP-43及β-TubulinⅢ蛋白表達的影響，探究蒲參膠囊對腦缺血后神經(jīng)再生修復的作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，96只，雄性，體質量250～280 g，SPF級，來源：北京維通利華實驗動物有限公司。許可證號：SCXK（京）2012-0001。動物合格證號：11400700173737。

1.2 試藥與儀器 1）藥物與試劑。蒲參膠囊粉劑（由蘇中藥業(yè)提供，藥物組成：何首烏、蒲黃、丹參、川芎、赤芍、山楂、澤瀉、黨參），實驗前用0.9%氯化鈉注射液溶解。鼠抗β3-Tubulin、兔抗GAP43：美國CST公司。鼠抗β-actin：美國ImmunoWay公司。羊抗兔二抗：Biosharp公司。羊抗鼠二抗：美國Abcam公司。2）儀器。球磨儀：德國Retsch公司。高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司。多功能酶標儀：TECAN公司。電泳槽、半干轉膜儀、蛋白印跡-多功能成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司。轉移搖床：海門市其林貝爾儀器有限公司。

1.3 分組與造模 將96只大鼠隨機分為5組，即假手術組、模型組、高劑量組（250 mg/200 g）、中劑量組（125 mg/200 g）、低劑量組（62.5 mg/200 g）。 造模成功后，所有大鼠均接受每日1次灌胃給藥。其中分別于7 d、14 d每組各取4只用于Western blotting檢測。大鼠飼養(yǎng)至250～280 g，采用頸內動脈線栓法制備大腦中動脈阻塞（MCAO）腦缺血再灌注模型［2］。根據(jù)下列標準納入研究：大鼠完全清醒后，出現(xiàn)右側虹膜顏色變淺，瞳孔縮小，左側偏癱（左上肢明顯），大鼠自主運動時，出現(xiàn)左轉圈，提尾懸空時，左前肢屈曲、內收為模型成功。如未出現(xiàn)上述癥狀，予以排除。神經(jīng)功能損傷評價參考改良Bederson 5分制法：0分為提尾懸空時，動物的兩前肢均伸向地板方向，且無其他行為缺陷；1分為提尾懸空時，動物的手術對（左）側前肢表現(xiàn)為腕肘屈曲、肩內旋、肘外展、緊貼胸壁；2分為將動物置于光滑平板上，推手術側肩向對側移動時阻力降低；3分為動物自由行走時，向手術對側環(huán)行或轉圈；4分為肢體軟癱，肢體無自發(fā)活動。0分及4分者予以排除。

1.4 干預方法 高劑量組（250 mg/200 g）、中劑量組（125 mg/200 g）、低劑量組（62.5 mg/200 g）于再灌注后，待大鼠清醒后灌胃給藥1次，其后每日給藥1次，假手術組、模型組灌胃給予0.9%氯化鈉注射液，給藥容積5 mL/kg。

1.5 神經(jīng)功能測定 參照《現(xiàn)代神經(jīng)科學研究方法》［3］采用神經(jīng)功能缺損評分標準（NSS），于術后第1日、第7日和第14日對造模大鼠進行評價，0分為無任何異常行為；1分為提起鼠尾，健側前肢內旋、肩內收為損傷較輕；2分為上述癥狀基礎上，置于光滑平面，向健側推擋時阻力減弱或動物轉圈追尾爬行，為中度損傷；3分為提起鼠尾，向患側旋轉，損傷較嚴重；4分為動物處于精神抑制狀態(tài)，不能進行自發(fā)活動。

1.6 GAP-43、β-TubulinⅢ蛋白表達的檢測 根據(jù)動物福利的相關規(guī)定，所采取的處死方式為二氧化碳安樂處死方式。而后，斷頭取腦，取每組大鼠的右側大腦皮層組織，應用 Western blotting檢測 GAP-43、β-TubulinⅢ蛋白的表達。經(jīng)轉膜等程序后按1∶1比例配制ECL發(fā)光液，上機曝光檢測。用Image Lab軟件處理各條帶的灰度值，用β-actin作內參，用目的蛋白與β-actin灰度值的比值作為目的蛋白的相對含量。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS16．0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示。Western blotting檢測結果采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。然后用LSD進行組內兩兩比較，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。不符合方差齊性檢驗的，對數(shù)據(jù)進行函數(shù)轉換后再行單因素方差分析及LSD兩兩比較。繪圖采用Grapthpad軟件繪制。

2 結 果

2.1 各組NSS評分比較 見表1。假手術組無神經(jīng)功能缺損，分別將低、中、高、模型組在第1日、7日、14日采用單因素方差分析，每組在各個時間點的NSS評分之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。但低、中、高劑量組在第14日時均有改善神經(jīng)功能的趨勢，而模型組在第14日時的評分與術后第1日相比有所下降，但趨勢并不明顯，且在術后第7日評分有增高的趨勢。

表1 各組NSS評分比較（分，x±s）

2.2 各組大鼠GAP-43、β-TubulinⅢ蛋白表達的比較見圖1，圖2，表2。1）各組GAP43蛋白表達比較：治療7 d，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。再經(jīng)LSD多重比較，低、中、高、假手術組分別與模型組比較：低劑量組GAP43表達升高，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；中劑量組 GAP43表達明顯升高（P＜0.01）；高劑量組GAP43表達升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；假手術組GAP43表達升高，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療14 d，各組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），不再進行 LSD 多重比較（見表 1，圖 1、圖 2）。 2）β-TubulinⅢ蛋白表達比較：治療7 d，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。再經(jīng)LSD多重比較，低、中、高、假手術組分別與模型組對比：低劑量組Tubulin表達降低，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；中劑量組Tubulin表達明顯升高（P＜0.05）；高劑量組Tubulin表達明顯降低（P＜0.05）；假手術組Tubulin表達升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療14 d，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），再經(jīng) LSD 多重比較，低、中、高、假手術組分別與模型組對比：低劑量組Tubulin表達升高，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；中劑量組Tubulin表達明顯升高；高劑量組Tubulin表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；假手術組Tubulin表達升高，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 7 d時GAP-43、β-TubulinⅢ蛋白的表達

圖2 14 d時GAP-43、β-TubulinⅢ蛋白的表達

3 討 論

傳統(tǒng)觀念認為，成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)內只有神經(jīng)元的死亡，沒有再生。 1992 年，Reynolds等［4］首次從成年小鼠腦紋狀體分離出神經(jīng)干細胞，打破了神經(jīng)細胞不能再生的傳統(tǒng)觀念，為神經(jīng)系統(tǒng)的損傷及疾病的治療提供了新思路。而神經(jīng)再生主要是指神經(jīng)干細胞增殖、遷移、分化整合入神經(jīng)回路中生成具有功能的神經(jīng)元。雖然近年來外源性神經(jīng)干細胞移植被提出有望治療中風后的神經(jīng)損傷［5］，但涉及倫理及免疫排斥未得到解決，臨床應用受限，內源性再生途徑可避免外源性再生途徑的相關問題，成為研究的熱點，因此最大程度地激活內源性神經(jīng)干細胞是治療腦缺血后神經(jīng)損傷的有效途徑［6］。

表1 各組GAP-43、β-TubulinⅢ蛋白的表達水平比較（x±s）

GAP-43是一種廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)內的特異性胞膜磷酸蛋白，主要沿神經(jīng)元軸突表達，其在軸突生長錐的質膜和突觸前終末表達明顯，在生長、分化、再生的軸突末端含量極高，它與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、突觸形成和可塑性以及神經(jīng)再生密切相關［7］。在神經(jīng)損傷和再生時，軸突內 GAP-43 的含量可增加 20～100 倍［8］。 國際上將GAP-43列為研究神經(jīng)生長發(fā)育和損傷修復等神經(jīng)可塑性的首選分子探針［9］。GAP-43在神經(jīng)元的發(fā)育和再生過程，伴隨著軸突生長在神經(jīng)組織內大量合成，是神經(jīng)再塑和再生的分子標志物。β-TubulinⅢ是微管蛋白家族的一種亞型，主要參與細胞骨架的構成，而細胞骨架與神經(jīng)干細胞分化成神經(jīng)元的過程相關，它不僅維持細胞形態(tài)，而且與細胞的運動、物質轉換、能量轉換、信息傳遞以及細胞分裂和分化、基因表達等重要生長活動相關［10-12］。β微管蛋白是神經(jīng)細胞特異性微管蛋白，被認為是神經(jīng)元發(fā)育的標志。

缺血性腦血管病主要因腦部血液循環(huán)障礙引起，蒲參膠囊主要應用于高脂血癥的治療，有較強的活血化瘀功能，對血液系統(tǒng)的調節(jié)有積極的作用。隨著臨床研究的深入，蒲參膠囊在腦梗死患者的運用價值也慢慢被挖掘。肖展翅等在蒲參膠囊對急性腦梗死臨床研究中發(fā)現(xiàn)，蒲參膠囊除具有降低血脂作用外，還可降低血液黏度，降低頸動脈內膜厚度，減少頸動脈斑塊大小和厚度，從而改善腦梗死患者微循環(huán)障礙［13］。何首烏補肝腎、益精血，蒲黃化瘀行血通經(jīng)，丹參、川芎、赤芍、山楂均有活血祛瘀之功，澤瀉利水滲濕，可泄水濕，行痰飲，黨參補氣補血生津?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，川芎的有效成分之一川芎嗪對神經(jīng)細胞及血管內皮細胞有抗凋亡作用，其另一有效成分阿魏鈉能抑制血小板聚集［14］，丹參能強有力地使纖維蛋白原裂解為纖維蛋白降解產(chǎn)物（FDP），減少纖溶酶激活物的抑制物（PAI），加強纖溶。丹參還可通過增加超氧化物歧化酶的含量，清除氧自由基，促進神經(jīng)功能恢復［15］，因此蒲參膠囊對缺血性腦血管病的防治具有一定的價值。

在本次實驗研究中，筆者通過頸內動脈線栓法制備大鼠MCAO腦缺血再灌注模型，通過對第1、14日等觀察點進行行為學評分，評價蒲參膠囊對腦缺血后功能恢復的情況，結果顯示蒲參膠囊雖然對大鼠腦缺血后神經(jīng)功能損傷的恢復有一定的改善趨勢，但作用并不明顯，可能與大鼠本身的梗死程度較重及觀察時間周期短相關。Western blotting結果顯示中劑量蒲參膠囊治療7 d時可明顯提高GAP-43和β-TubulinⅢ蛋白的表達，說明中劑量蒲參膠囊短期內即有效，起效迅速；治療14 d，中劑量蒲參膠囊對β-TubulinⅢ蛋白的表達也有升高作用，具體用藥療程有待進一步研究探討，治療14 d，蒲參膠囊對GAP43的蛋白表達影響不明顯。以上結果說明蒲參膠囊中等劑量在一定程度上可以促進腦缺血后的內源性神經(jīng)再生，促進神經(jīng)損傷的修復，但其量效關系還需進一步驗證。

綜上所述，蒲參膠囊在以往的臨床應用中具有降低血液黏度，改善血管功能的作用，而本次的動物實驗可初步證實蒲參膠囊可通過促進內源性神經(jīng)再生，達到促進腦缺血神經(jīng)功能損傷的恢復，為拓展中醫(yī)藥的用藥范圍及在神經(jīng)再生領域的臨床應用提供了理論基礎和實驗依據(jù)。