金 曼，吳 娟綜述，黎筆熙審校

0 引 言

細胞凋亡是細胞對環(huán)境條件變化產生的有序應答過程，該過程有助于維持細胞穩(wěn)態(tài)，線粒體在其中扮演了重要的角色。線粒體俗稱為“細胞的能量工廠”，主要通過產生ATP、維持線粒體膜電位（Δ ψm）穩(wěn)定和釋放凋亡相關因子來調控細胞［1］。在細胞凋亡機制中，線粒體膜通透性改變（mitochondrial permeability transition，MPT）是關鍵環(huán)節(jié)，其主要由線粒體膜通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）進行調節(jié)。當mPTP 開放增加，線粒體膜電位下降，線粒體膜通透性增加，線粒體內促凋亡因子，如：細胞色素c（Cyt c）、凋亡誘導因子（apoptosis inducing factor，AIF）、線粒體促凋亡蛋白（SMAC/DIABLO、HTRA2/OMI、ENDOG）釋放到細胞質中。本文將對mPTP 的結構模型及其各組分在細胞凋亡機制中的作用進行綜述。

1 線粒體概述

線粒體是細胞內最重要的器官之一，它的損傷與多種疾病過程相關聯(lián)，比如急性肺損傷、腦損傷、肝損傷等［2］。線粒體對內環(huán)境改變非常敏感，在凋亡早期即可發(fā)生變化。線粒體首先整合細胞內起始的凋亡信號，接著通過傳遞信號，可迅速改變細胞存亡狀態(tài)［3］。研究認為線粒體由四個部分組成：外膜、內膜、膜間隙和細胞基質，其中致密的細胞基質被包裹在內膜內，內膜是線粒體的主要功能單元，它是電子傳遞鏈和ATP 合酶的組分，內膜可折疊成復雜的嵴，增加可用于氧化磷酸化的表面積，從而提高能量產生的效率［4］。線粒體外膜由“孔道蛋白”構成，它是幾種蛋白質共同構成的整合蛋白，為高通透性，可允許小分子和離子自由通過；相較之下內膜為低通透性，幾乎所有物質都需要跨膜轉運蛋白才能進出，這種高-低通透性形成了Δψm，正常的Δψm 是維持線粒體正常功能所必需的。當線粒體受損傷產生應激或受到刺激后，線粒體內膜通透性可在短時間內迅速升高，一些平時不能通過的離子和分子得以穿過線粒體內膜，導致線粒體功能障礙，最終造成細胞的凋亡［5］。

2 MPT及其與凋亡的關系

研究發(fā)現(xiàn)，線粒體凋亡與其功能狀態(tài)緊密相關，線粒體可在細胞內傳遞凋亡信號，如從細胞質到細胞核，而在這一傳遞過程中，MPT 起了重要作用［6］。MPT 的特征性改變?yōu)椋壕€粒體大面積腫脹以及Ca2+超載［7］，研究發(fā)現(xiàn)，這種改變是由于一種孔道結構開放引起的，這種孔道結構即為mPTP［8］。在正常情況下，mPTP 僅容許相對分子質量＜1500 000 的溶質通過，當開放程度增大時會導致胞質中大量相對分子質量＞1500 000 的物質非選擇性擴散入線粒體內膜，造成線粒體膜電位下降、呼吸鏈與氧化磷酸化解耦連、ATP合成減少［9-10］。大分子物質如蛋白質等穿過線粒體內膜進入線粒體基質，導致線粒體基質的膠體滲透壓大大高于細胞質，于是滲透壓較低的液體擴散進入線粒體，造成線粒體大面積腫脹，因為有線粒體嵴的存在，所以線粒體膜有很大伸展空間。此時在電鏡下可見典型的線粒體基質密度降低、基質顆粒減少或消失，線粒體嵴變短、減少、邊移。在失血性休克/再灌注損傷的動物實驗研究中發(fā)現(xiàn)，MPT 的發(fā)生可以有兩種結局：凋亡和壞死［8，11］。發(fā)生MPT 后的細胞會出現(xiàn)線粒體膜電位（Δ ψm）喪失，以及后續(xù)依賴線粒體膜電位的合成過程停滯，如ATP生成，ATP生成停滯、ATP耗竭、糖酵解ATP生成三者之間的平衡決定著細胞的命運［6，8］。

當受到各種損傷因子影響以及受體介導的刺激信號的干擾后，線粒體內可發(fā)生Ca2+蓄積，此外還有很多其他致凋亡途徑，比如活性氧分子（reactive oxygen species，ROS）途徑等，但最終都歸結于MPT。此外還有多種物質可導致MPT，如無機磷酸鹽和蒼術苷和羧基蒼術苷［12］。

發(fā)生MPT 的線粒體會釋放多種細胞因子，如Cyt-c、SMAC/DIABLO、AIF、HTRA2/OMI、ENDOG等。AIF 是一種線粒體黃素蛋白氧化還原酶，在細胞凋亡信號產生后，線粒體釋放出AIF 和ENDOG，隨后AIF、ENDOG 轉移至細胞核，引起細胞核中的染色體凝聚和DNA片段化，從而導致細胞凋亡［13-15］。研究表明，MPT 抑制劑能有效改善細胞凋亡，減少典型凋亡現(xiàn)象出現(xiàn)，所以抑制MPT 可以起到對凋亡的限速作用。

3 mPTP結構模型

在20 世紀90 年代早期，基于純化線粒體（即剝去外膜的線粒體）的電生理學研究證明，MPT 的出現(xiàn)是由于線粒體內膜的導電性顯著增加，表明存在一個孔道結構促成這種電子交換。經過十余年的研究，現(xiàn)在普遍認為mPTP 是由多種蛋白質組成的復合蛋白通道，一般在病理情況下才會開放［12，16］。目前認為，位于線粒體內膜的腺苷酸轉運體（adenine nucleotide translocase，ANT）、磷酸鹽載體（phosphatic carrier，PiC）、金屬蛋白酶、c 環(huán)內解耦連通道F1FO-ATP 合成酶［17］，以及位于線粒體外膜的電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion-selective channel，VDAC）和位于基質的親環(huán)蛋白D（cyclophilin D，Cyp D）是mPTP 的基本組成部分［18］，基質 中 的Bcl-2 蛋 白 家 族、己 糖 激 酶I（hexokinaseI，HKI）等對其進行調節(jié)［19］。

4 mPTP各組成部分在MPT中的作用

4.1 ANT 與MPTANT是位于線粒體內膜上的小分子蛋白，屬于線粒體溶質轉運體家族（solute carrier，SLC25a），最開始研究者注意到ANT 是因為發(fā)現(xiàn)mPTP 的形成和開放都非常依賴ATP/ADP，由于ANT 是核苷酸中唯一的線粒體轉位酶，因此它是能量產生和能量消耗過程之間最重要的聯(lián)系。在體外ANT 重組系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，ANT 具有通道活性，這與線粒體有通透性的假設相似。目前已知哺乳動物ANT 有3 個 亞 型，分 別 為ANT1、ANT2 和ANT3，ANT1 和ANT3 的作用是共同將線粒體基質內ATP和細胞質內ADP 進行交換，ANT2 是一種生長調節(jié)基因，已知在多種增殖細胞中高表達。ANT 的底物結合位點分為面向胞質的（c構象）和面向基質的（m構象），ANT 通過改變構象來調節(jié)mPTP 開關。當用可導致mPTP 開放的蒼術苷進行實驗時發(fā)現(xiàn)c 構象開放，而用可抑制mPTP 開放的米酵菌酸實驗時發(fā)現(xiàn)ANT轉向m構象［20］。

研究發(fā)現(xiàn)，同時敲除編碼兩種不同ANT 亞型（編碼ANT1 的Slc25a4 和編碼ANT2 的Slc25a5）的基因，仍能誘導鼠肝細胞發(fā)生MPT，并伴隨Cyt-c 釋放。進一步研究發(fā)現(xiàn)，從Slc25a4-/-Slc25a5-/-鼠肝細胞中分離出的線粒體在去極化劑的作用下會發(fā)生MPT，但對其應用蒼術苷后并不產生MPT，由此可見ANT 或許參與不依賴mPTP 開放的細胞凋亡。誘導Slc25a4-/-Slc25a5-/-細胞mPTP 開放需要更高濃度的Ca2+，當用ROS 處理該細胞時，由于Bax 釋放也會引起細胞凋亡，環(huán)孢菌素A（ciclosporin A，CsA）有一定保護作用。綜上所述，猜測ANT 在mPTP 的形成和開放過程中主要起調節(jié)作用，而非關鍵作用［21］。

4.2 VDAC 與MPTVDAC 是陰離子通道蛋白家族，相對分子質量約33 000，位于線粒體外膜脂質雙分子層中，離體重建純化的VDAC 分子顯示其能夠形成二聚體通道，表現(xiàn)出與線粒體通道相似的通道活性［22］。VDAC 主要參與細胞能量代謝，在細胞質和線粒體膜間隙的物質運載中起橋梁作用，主要傳遞包括Ca2+、水、代謝物質和ADP/ATP 等在內的物質［23］。VDAC 在細胞質的核糖體中合成，由核基因編碼，哺乳動物的VDAC 有3 個等位基因，分別為VDAC1、VDAC2、VDAC3［24］，當運用基因敲除方法去掉成纖維細胞等位基因VDAC1和VDAC3后，在Ca2+超載或Bax 活化時，這些細胞與野生型細胞一樣會發(fā)生線粒體腫脹，甚至腫脹程度超過野生型細胞；至于VDAC2 缺失則會造成胚胎期死亡。另有研究發(fā)現(xiàn)，促凋亡蛋白Bax 導致的Cyt-c 釋放在野生型小鼠和VDAC 基因缺失小鼠的線粒體內沒有明顯差異。綜上，說明VDAC 并不是mPTP 的必要組成部分［25-26］。

4.3 Cyp D 與MPTCyp D 是核基因編碼的相對分子質量為21 000 的親環(huán)蛋白，具有肽基脯氨酸順反異酶（PPIase）活性［27］。線粒體基質內編碼Cyp D的基因是Ppif，敲除該基因可獲得缺乏Cyp D 的Ppif-/-小鼠［28］。Ppif-/-小鼠的mPTP 對Ca2+過載誘導的mPTP開放有很大耐受性，對CsA（一種已知的mPTP開放抑制劑）不敏感。野生型小鼠和Ppif-/-小鼠對線粒體去極化、細胞基質pH 值、Cyt c 釋放等反應結果類似。由此可見，敲除Ppif 后mPTP 仍能自由開放，說明Cyp D并非mPTP的必需成分，但是可通過促進ANT中Ca2+觸發(fā)的構象變化來調節(jié)mPTP敏感性［29］，近年來研究表明，CypD可能與F1FO-ATP合成酶復合物的寡霉素敏感性蛋白亞基靜電相互作用，以觸發(fā)mPTP開放［17］。

4.4 PiC 與MPT有研究指出，缺乏ANT 同種亞型的mPTP 功能保持完整是由于線粒體載體家族其他成員發(fā)揮了補充作用，比如PiC［30］。哺乳動物線粒體內膜的PiC 由單個基因編碼，作為線粒體Pi 穿過線粒體內膜的主要運載體，在ATP 合成中起重要作用。生理情況下，在合成ATP 時，PiC 催化細胞質中作為ATP 合成底物的Pi 進入線粒體，促進氧化磷酸化順利進行，同時也參與一些磷酸化反應。既往研究顯示，PiC 以CsA 敏感的方式調節(jié)Cyp D，所以CsA 可直接影響PiC 與Cyp D 的結合，已明確CsA 直接作用于mPTP，因此認為PiC 或許參與mPTP 的構成。研究發(fā)現(xiàn)，所有已知的mPTP 開放調節(jié)劑，都可以與此兩種蛋白質結合，如苯基胂氧化物，N-乙基馬來酰亞胺和泛醌類似物。另有研究發(fā)現(xiàn)，敲除PiC 基因能減少Cyt-c 的釋放，減少凋亡［31］，然而也有研究顯示敲除PiC 基因的線粒體，mPTP 僅顯示出對激活劑的敏感性略微降低［32］，結合所有已知結果，與mPTP 的結構模型猜想一致，至少Ca2+過載、Cyp D 促進的PiC 變化、ANT 構象狀態(tài)與mPTP 開放程度密切相關。

4.5 Bcl-2 蛋白家族與MPTBcl-2 蛋白家族凋亡調節(jié)因子主要參與調控線粒體外膜通透性，其促凋亡成員Bax、Bad和Bak和抗凋亡成員Bcl-2和Bcl-xL在線粒體膜上的平衡狀況決定了細胞的存亡［33-34］。也有研究認為，Bax 和Bak 參與mPTP 的組成，尤其在病理情況下，理由是當遺傳修飾后缺乏Bax和Bak表達的小鼠對誘導mPTP 開放的物質具有抵抗性。mPTP 與細胞能量代謝狀態(tài)之間的關鍵聯(lián)系由葡萄糖代謝的第一種酶—HK 調節(jié)。HK 有兩個同種亞型，分別是HKI 和HKII，它們均對葡萄糖有高度親和力，并且具有疏水性的NH2末端，因而可直接與線粒體外膜相接。HKII 從線粒體解離會引起細胞凋亡，機制是：HKII 和Bcl-xL 競爭性與VDAC 結合，當HKII 與VDAC 分離后，Bcl-xL 立馬與Bax 解離轉而與VDAC結合，被解離的的Bax與Bak結合形成線粒體外膜上開放的孔道，促凋亡蛋白Cyt-c 等能經過Bax-Bak 形成的孔道釋放到胞質，使細胞發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在編碼Bax 和Bak 基因遺傳失活的情況下，線粒體外膜通透性下降而線粒體內膜通透性無顯著改變，由此說明Bax 和Bak 不會直接調控線粒體內膜通透性，因此由Bax 和Bak 介導的細胞凋亡并不依賴mPTP 的開放［35］，而敲除VDAC 基因的小鼠細胞，HKII 從線粒體脫離仍能引起mPTP 開放和細胞凋亡，說明Bcl-2蛋白家族可直接調控MPT。

5 mPTP與細胞凋亡

有文獻表明，mPTP 的開放程度由單個孔道開放時間以及單個線粒體上開放的孔道數(shù)量決定［36］。一方面mPTP 開放使電子通過線粒體內膜更加容易，導致線粒體膜電勢和pH 梯度改變，線粒體功能障礙，合成ATP減少，同時使得ATPase酶活性改變，造成細胞質ATP 消耗增加，能量代謝被破壞。受能量影響最大的離子泵功能障礙，導致Ca2+失調，進一步加劇mPTP 開放［37］。另一方面，mPTP 開放使小分子物質，如輔酶因子、離子等可以穿越線粒體內膜，不僅造成線粒體與細胞質之間代謝物質的梯度不平衡，還引起線粒體基質腫脹。線粒體基質腫脹本身可以不引起線粒體內、外膜破裂，因為線粒體嵴可以延展開以擴大基質容積，但這會對線粒體外膜產生壓力，當超過一定程度會導致線粒體內、外膜破裂［16，26］。研究證實mPTP 開放造成線粒體內膜通透性改變使得Cyt-c 從線粒體釋放到細胞質［38］，Cytc 的釋放是線粒體凋亡的重要信號，可激活caspase-3/9，從而誘導細胞凋亡的發(fā)生。

6 影響mPTP開放的因素

6.1 線粒體基質內存在的影響因子線粒體基質內調節(jié)mPTP 開放程度的關鍵是二價陽離子濃度，如Ca2+、Sr2+、Mn2+、Mg2+等。mPTP 開放需要線粒體基質內Ca2+超載，中和Ca2+能使其迅速關閉。Mg2+會降低mPTP 的敏感性，當腺苷存在時，此二種物質會產生協(xié)同效應。此外，可使mPTP 發(fā)生脫敏的還有Sr2+以及Mn2+，這是因為Sr2+、Mn2+、Mg2+等陽離子會影響線粒體基質內Ca2+濃度，甚至競爭性結合Ca2+結合位點。

6.2 pH 值mPTP 會受細胞基質pH 值影響，當pH值為7.4 時，是最適合mPTP 開放的。pH 值過高或過低都會大大降低mPTP開放程度［39］。

6.3 CsA 和Cyp DCsA 可 阻 止Cyp D 與ANT 結合，從而抑制mPTP 開放。既往認為敲除Ppif 基因或用其特異性抑制劑CsA 抑制mPTP 開放時［40］，必需有Pi 存在，然而最新研究表明不論Pi 是否存在，CsA均能抑制mPTP開放［41］。

6.4 線粒體內膜的穩(wěn)定性線粒體內膜負電位有助于穩(wěn)定mPTP 的閉合構象，當去極化時有利于mPTP 開放，因此當H+和K+進入線粒體內膜時促進mPTP 開放，線粒體內膜干擾劑可影響mPTP 開放，如兩性陰離子有利于mPTP 開放，而聚陽離子、兩性陽離子和正電荷肽不利于mPTP開放［42-43］。

7 關于mPTP在臨床上的最新研究進展

大量的藥理學和遺傳學證據(jù)表明Cyp D 是唯一的、普遍接受的蛋白質修飾因子和mPTP 開放的關鍵調節(jié)因子。Cyp D 的PPIase 活性是調節(jié)mPTP 開放的關鍵。此外，調節(jié)性、非結構性相互作用使Cyp D 成為多種功能不同的蛋白質和潛在的mPTP 調節(jié)劑之間的信號傳導中樞，如p53、補體C1Q 結合蛋白和β淀粉樣蛋白。在線粒體外膜和內質網之間的交界處還發(fā)現(xiàn)了線粒體相關膜組分中的Cyp D，此處的Cyp D 位于VDAC1/Grp75/IP3R 復合物中，它正向調節(jié)內質網-線粒體Ca2+交換和線粒體Ca2+負荷，由此調控mPTP 開放。最新的研究模型提示Cyp D 與F1FO-ATP 合成酶的側莖之間有功能性相互作用，與Cyp D 結合降低了F1FO-ATP 合成酶復合物的活性，當環(huán)境中有Pi 時可以使得mPTP 易被CsA 抑制，有人推測F1FO-ATP 合成酶復合物的寡霉素敏感性賦予蛋白亞基作為Cyp D 結合位點。鑒于Cyp D 敲除與線粒體對應激物耐受性增加之間的明確關系，Cyp D 通過直接抑制或調節(jié)蛋白質-蛋白質相互作用，代表了有效的治療策略［44］。

7.1 直接抑制Cyp D 的臨床藥物目前直接抑制Cyp D 的最佳藥物仍然是CsA，CsA 是一種疏水性十一肽和非選擇性親環(huán)蛋白抑制劑和免疫抑制劑，結合并阻塞親環(huán)蛋白PPIase 活性位點，在心臟缺血再灌注損傷中mPTP開放的臨床前模型中，CsA表現(xiàn)出狹窄的有效濃度范圍，在濃度0.2 mmol/L 時觀察到心臟保護作用，濃度高于0.4 mmol/L 時產生心肌毒性作用。這種狹窄的治療窗通常會使離體心肌細胞的臨床前研究變得艱難，并且會使臨床使用復雜化［45］。

7.2 通過Cyp D 非依賴性機制作用于mPTP目前研究中使用的CypD 非依賴性抑制劑TRO-40303可與轉運蛋白（相對分子質量為18000）的膽固醇結合位點結合。有研究表明TRO-40303 可在體外和體內再灌注損傷后延遲氧化應激誘導的mPTP 開放。在另一些小鼠的研究中，TRO-40303 在mPTP形成、調節(jié)或mPTP 介導的心肌細胞凋亡中沒有作用。盡管如此，TRO-40303 仍進入了2 期臨床試驗，研究結果提示：在原發(fā)性經皮冠狀動脈介入治療前給予TRO40303 不影響促炎性細胞因子或急性期蛋白質的水平［46］。

8 結 語

mPTP 與細胞凋亡關系密切，目前人們對其結構組成、調控機制及實際功能等尚未完全了解，我們相信隨著研究深入以及新科技的運用，一定會對其有更全面且充分的認識。抑制細胞凋亡是干預多種疾病進展的有效手段，目前比較明確的是通過抑制mPTP 開放可抑制細胞凋亡，因而積極開展可抑制mPTP 開放的干預措施有助于人類更好地預防和治療疾病。