胡瓊源綜述，任建安審校

0 引 言

膿毒癥是導(dǎo)致重癥患者死亡的重要因素，早期診療對膿毒癥的預(yù)后極具意義［1］。目前早期診斷膿毒癥的標(biāo)志物敏感性較低。2004年，Brinkmann等［2］首次發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs），并闡明NETs 結(jié)構(gòu)及其作用。隨后研究發(fā)現(xiàn)NETs 有望成為膿毒癥早期診斷的新型標(biāo)記物。早期NETs 的形成可抵御病原微生物入侵，但近來研究證實(shí)，持續(xù)過度的NETs 可誘導(dǎo)炎癥放大、促進(jìn)組織損傷，引起腸屏障損傷及免疫功能紊亂。本文就NETs 與膿毒癥及腸屏障功能障礙最新研究進(jìn)展作一綜述。

1 NETs的形成機(jī)制

1.1 NETs的基本特征中性粒細(xì)胞在多種微生物或炎癥介質(zhì)的刺激下活化，通過氧化應(yīng)激、炎癥介導(dǎo)等作用，向胞外釋放一種以DNA 為骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含組蛋白、彈性蛋白酶等抗菌蛋白，稱之為NETs。電鏡下結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為15～17 nm 長度的平滑肌纖維和25 nm 左右鑲嵌于DNA 骨架的球形區(qū)域［2］。NETs依賴于特有的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)捕獲病原菌，并通過抗菌蛋白殺滅病原體。

1.2 NETosis-釋放NETs 死亡方式NETs 的形成過程被稱為NETosis。2007 年，F(xiàn)uchs 等［3］首次發(fā)現(xiàn)一種新型的細(xì)胞死亡過程，即NETosis。與凋亡不同的是，NETosis 不會出現(xiàn)DNA 碎片化，同時(shí)不依賴于caspase 級聯(lián)。NETosis 與壞死過程也存在差異，NETs形成早期即出現(xiàn)細(xì)胞核囊泡化，使得解聚的染色質(zhì)和抗菌物質(zhì)在釋放前相互結(jié)合。NETs 成型后以線狀、網(wǎng)狀等多種形態(tài)聚集中性粒細(xì)胞周圍，或以棉絮狀游離于循環(huán)之中。當(dāng)NETs 的形成與清除失衡，則具有細(xì)胞毒性作用，參與炎癥放大及血栓形成等病理過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，肽基精氨酸脫亞氨酶4（peptidyl arginine deaminase 4，PAD4）對于NETs 形成發(fā)揮重要作用［4］。脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）則被證實(shí)能夠有效降解NETs。

2 NETs在膿毒癥中的正面作用

NETs 通過電荷間相互作用與病原微生物相互結(jié)合，實(shí)現(xiàn)誘捕細(xì)菌。NETs 能夠結(jié)合弗氏志賀氏菌，金黃色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌，白色念珠菌和利什曼原蟲等多種病原微生物。Buchanan等［5］使用表達(dá)DNase 的A 組鏈球菌處理小鼠，皮膚病變更嚴(yán)重，細(xì)菌傳播更廣泛。這提示NETs 不僅能夠殺滅細(xì)菌，還能阻礙細(xì)菌傳播。McDnald 等［6］利用熒光標(biāo)記大腸桿菌，分析LPS 處理小鼠后肝臟內(nèi)細(xì)菌誘捕情況，結(jié)果提示，當(dāng)肝內(nèi)巨噬細(xì)胞被廣泛的菌血癥淹沒時(shí)，肝內(nèi)NETs 將會誘捕細(xì)菌。具有快速降解DNA 能力的微生物毒性更強(qiáng)。如肺炎鏈球菌表達(dá)的endA 可降解DNA，從而破壞NETs，因此可加劇膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。NETs通過其組分組蛋白，組織蛋白酶G 和髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）發(fā)揮抗菌活性。近來研究證明，NETs 可通過MPO和組織蛋白酶G 激活I(lǐng)L-1 和IL-36 等細(xì)胞因子［7］。NETs 捕獲細(xì)菌依賴于DNA 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，一旦核酸酶破壞其結(jié)構(gòu)，NETs抗菌結(jié)構(gòu)就消失。

3 NETs在膿毒癥中的負(fù)面影響

雖然NETs 在膿毒癥早期通過限制細(xì)菌的增殖及播散保護(hù)機(jī)體，但膿毒癥過程中過度NETs 的形成會導(dǎo)致組織損傷。NETs 在膿毒癥中扮演“雙刃劍”作用，在發(fā)揮抗病原微生物同時(shí)，也能夠促進(jìn)血栓形成，引起彌漫性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）及器官功能障礙的發(fā)生，最終導(dǎo)致膿毒癥患者死亡率增加。

3.1 NETs與血栓形成膿毒癥時(shí)大量的炎癥因子引起系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，誘發(fā)凝血系統(tǒng)的激活。正常生理下，抗凝通路（包括有組織因子信號，抗凝血酶，血栓調(diào)節(jié)蛋白等）能夠防止過度的血栓形成，但是在膿毒癥過程，持續(xù)的凝血信號將會打破抗凝系統(tǒng)，引起血管內(nèi)凝血。最終機(jī)體的凝血蛋白以及血小板的耗竭導(dǎo)致凝血功能障礙或DIC。膿毒癥晚期DIC 表現(xiàn)為出血或MOF。研究證實(shí)，NETs 通過促進(jìn)血栓形成，激活血小板，抑制抗凝通路等途徑誘導(dǎo)DIC［4］。臨床觀察發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者循環(huán)高表達(dá)游離DNA（cell-free DNA，cfDNA），且通過多種途徑影響血栓形成［8］。Gould 等［9］發(fā)現(xiàn)血漿中cfDNA 水平與凝血酶生成的程度和速率呈正相關(guān)。cfDNA 憑借其雙鏈DNA 結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白因子XII 和激肽，加速前激肽釋放酶的激活，促進(jìn)凝血進(jìn)程。此外，cfDNA 不僅通過抑制組織纖溶酶原激活劑來損傷纖維蛋白溶解，還通過構(gòu)建紅細(xì)胞、血小板、纖維蛋白和凝血因子結(jié)構(gòu)的支架強(qiáng)化微血栓超微結(jié)構(gòu)［4］。除cfDNA，NETs 其他組成成分（細(xì)胞外組蛋白，中心粒細(xì)胞彈性蛋白，組織蛋白酶G）同樣發(fā)揮促凝血作用。研究證實(shí)，阻斷NETs能明顯改善膿毒癥小鼠DIC凝血指標(biāo)及微循環(huán)灌注。

3.2 NETs與器官功能障礙

3.2.1 NETs 與肺損傷急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是臨床上常見危重癥，進(jìn)展形成急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。ARDS是膿毒癥的致命性并發(fā)癥，特征表現(xiàn)為肺泡-毛細(xì)血管屏障的破壞，引起內(nèi)皮和上皮細(xì)胞的通透性增加，導(dǎo)致高蛋白性水腫甚至呼吸衰竭。中性粒細(xì)胞從脈管系統(tǒng)遷移到間質(zhì)和支氣管肺泡腔是膿毒癥并發(fā)ARDS 的關(guān)鍵特征。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥過程中NETs 被激活，并誘導(dǎo)ALI 發(fā)生［10］。Maruchi 等［11］發(fā) 現(xiàn) 循 環(huán) 中MPO-DNA 水 平 與 氧 化 指 數(shù)PaO2/FiO2呈正相關(guān)。Mikacenic 等［12］發(fā)現(xiàn)ARDS 患者肺泡灌洗液中NETs 表達(dá)較循環(huán)NETs 更高，進(jìn)一步研究證實(shí)，肺泡中NETs 可激活炎癥應(yīng)答，導(dǎo)致肺部局灶性炎性損傷。體外研究表明，NETs可改變上皮細(xì)胞的肌動蛋白細(xì)胞骨架增加肺泡上皮細(xì)胞通透性；NETosis 過程中釋放到胞外的組蛋白也可加劇中性粒細(xì)胞的積聚遷移，并引起肺泡上皮的直接破壞，導(dǎo)致肺泡通透性屏障的破壞。機(jī)制上，NETs可通過激活TLR4 或NLRP3 等信號通路誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)大量分泌，導(dǎo)致肺功能障礙［13］。

3.2.2 NETs 與肝損傷膿毒癥中，庫普弗細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞招募大量中性粒細(xì)胞。中性粒細(xì)胞通過NETs 發(fā)揮抗菌作用，實(shí)現(xiàn)抗感染。這個(gè)過程使肝臟成為膿毒癥中NETs 形成的中心器官。然而，過度NETs 的形成也會導(dǎo)致肝和其他宿主器官的細(xì)胞受損。雖然組蛋白和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶具有抗菌能力，但是他們對宿主上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞也有毒性。重要的是，NETs固定在肝竇上的時(shí)間長達(dá)24 小時(shí)［14］。DNase 雖然能夠降解DNA，但無法去除任何蛋白，只能部分降低蛋白酶解活性或相關(guān)的肝毒性。在膿毒癥早期階段，適度的NETs 形成能夠殺滅細(xì)菌，改善組織損傷，在膿毒癥中晚期，過度的NETs 形成將會介導(dǎo)炎癥因子大量分泌，導(dǎo)致肝組織損傷。因此，深入了解NETs 形成機(jī)制有助于及時(shí)進(jìn)行膿毒癥治療。

3.2.3 NETs 與腎損傷腎是膿毒癥的易損器官，嚴(yán)重膿毒癥患者中，22%～53%合并急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）。AKI特征表現(xiàn)為管狀上皮細(xì)胞壞死、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及強(qiáng)大的組織炎癥。Nakazawa 等［15］發(fā)現(xiàn)急性腎小管壞死患者腎組織高表達(dá)NETs 組分，且NETs 可誘導(dǎo)壞死性炎癥。在急性腎損傷過程中，管狀上皮細(xì)胞的壞死是導(dǎo)致?lián)p傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）釋放和NETosis 誘導(dǎo)的始動因素。DAMPs 可誘導(dǎo)大量的NETs 形成。NETs 及其組分可作為壞死性炎癥的介質(zhì)，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞廣泛性損傷。腎小管細(xì)胞壞死和NETs 形成之間以“惡性自循環(huán)”方式加重腎損傷，并誘導(dǎo)MOD。Biron等［16］發(fā)現(xiàn)在膿毒癥模型中，降低NETs 形成可下調(diào)腎組織炎癥因子，肌酐及尿素氮水平，明顯改善膿毒癥導(dǎo)致的腎功能障礙。

4 NETs在腸屏障功能發(fā)揮的作用

胃腸道中的許多細(xì)菌，真菌和寄生蟲可刺激NETs 形成。NETs 能夠有效的防止病原體入侵，發(fā)揮防御功能。然而，活化的中性粒細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，NETs及其組分可損傷腸上皮［17］。雖然NETs能夠清除有害菌，控制腸源性感染，但NETs也可誘導(dǎo)腸道炎癥應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型糖尿病患者循環(huán)NETs 表達(dá)與腸屏障損傷標(biāo)志物（連蛋白及LPS）呈正相關(guān)，這提示NETs 升高與腸滲透性增高密切相關(guān)［18］。Dinallo 等［19］發(fā)現(xiàn)，用LPS 或TNF-α 處理潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）外周血中性粒細(xì)胞，可明顯誘導(dǎo)NETs 形成。此外，在UC 患者腸黏膜中表達(dá)NETs 標(biāo)記物，且腸管炎癥活躍區(qū)域NETs表達(dá)更加明顯。通過NETs刺激腸原代固有層單核細(xì)胞，可明顯誘導(dǎo)IL-1β 和TNF-α 分泌，但DNase 預(yù)處理能夠消除NETs 的促炎效應(yīng)。此外，在兒童炎性腸病腸黏膜中NETs 同樣高表達(dá)，并且參與腸黏膜炎癥反應(yīng)與免疫應(yīng)答［20］。由此可見，NETs在腸道黏膜炎癥發(fā)揮重要的作用。Gao 等［21］發(fā)現(xiàn)膿毒癥時(shí)，NETs 能夠損傷腸道黏膜。LPS 造模后，免疫熒光觀察到大鼠腸組織中有大量中性粒細(xì)胞浸潤，且可觀察NETs 廣泛分布在大鼠腸固有層中。DNase處理后，腸黏膜中產(chǎn)生的NETs被有效降解，且可有效降低腸細(xì)胞凋亡指數(shù)，改善腸道炎癥。在腸缺血再灌注模型中，靜脈注射DNase 可明顯改善NETs參與的腸屏障損傷［22］。

NETs參與腸屏障損傷的機(jī)理十分復(fù)雜。首先，NETs 或其組分可直接誘導(dǎo)細(xì)胞死亡及腸細(xì)胞大量凋亡，誘導(dǎo)腸黏膜損傷；再者，NETs被證實(shí)可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起血管通透性增加，影響組織氧化作用，這為NETs 可損傷腸道微循環(huán)，損傷腸黏膜血管提供理論依據(jù)；最后，NETs 的炎癥放大作用也是膿毒癥中腸屏障損傷的重要因素。對于膿毒癥中NETs導(dǎo)致腸屏障損傷的機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

5 NETs的臨床應(yīng)用

膿毒癥臨床預(yù)后依賴早期識別和及時(shí)干預(yù)，臨床檢測NETs 水平有望成為早期診斷膿毒癥重要的標(biāo)記物。前期證實(shí)，通過ELISA，流式技術(shù)等方法檢測cfDNA，組蛋白及核小體等能夠體現(xiàn)NETs形成的程度。Maruchi等［23］證明NETs在膿毒癥早期階段快速形成，且參與膿毒癥休克發(fā)生的病理生理機(jī)制。此外，針對NETs 產(chǎn)生及組分的治療性干預(yù)有望成為膿毒癥臨床治療的新策略新方法。Mai 等［24］發(fā)現(xiàn)延遲性（CLP后2 h）腹腔注射DNase可降低循環(huán)cfDNA 及炎癥介質(zhì)，改善組織損傷，降低菌群易位。同時(shí)，DNase 和抗菌素聯(lián)合治療效果更加顯著。這揭示了，通過聯(lián)合DNase和臨床常規(guī)治療手段（液體復(fù)蘇、抗生素等）可優(yōu)化膿毒癥臨床治療療效。

鑒于PAD4 在膿毒癥誘導(dǎo)NETosis 形成發(fā)揮的重要作用，可將其作為合適的治療靶點(diǎn)。在狼瘡小鼠模型中，PAD4 抑制劑能夠保護(hù)NETs 介導(dǎo)的血管損傷、內(nèi)皮功能障礙和腎損傷［25］。在膿毒癥模型中，PAD4 敲除可改善生存率并降低器官功能障礙的嚴(yán)重程度［26］。除PAD4，citH3 也是膿毒癥治療潛在的治療靶點(diǎn)。Li 等［27］發(fā)現(xiàn)在膿毒癥中，中和循環(huán)citH3 能夠改善小鼠生存率。通過非抗凝血肝素結(jié)合citH3 可明顯降低組蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，改善LPS 導(dǎo)致的肺損傷，提高膿毒癥小鼠生存率［28］。阻斷NETs形成或降解NETs組分在膿毒癥小鼠模型的治療療效已得到證實(shí)，但未見臨床試驗(yàn)證實(shí)NETs相關(guān)措施治療膿毒癥。今后需要開展臨床試驗(yàn)驗(yàn)證以NETs為靶點(diǎn)，探討在膿毒癥中的療效。

6 結(jié) 語

膿毒癥中NETs 的形成可誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答，血栓形成及器官功能障礙。通過調(diào)節(jié)NETs 的形成，釋放等多個(gè)靶點(diǎn)可阻斷NETosis，阻斷炎性反應(yīng)與凝血的相互作用，為膿毒癥治療提供新的治療思路和方向。但由于NETs 結(jié)構(gòu)的特殊性，目前其濃度檢測尚未用于臨床。今后，需進(jìn)一步完善、精確NETs檢測，實(shí)現(xiàn)膿毒癥臨床預(yù)后的早期識別。