蘆小單,楊天時,劉 磊,方艷秋,林秀英

(1.吉林省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，吉林長春130021；2.長春中醫(yī)藥大學醫(yī)學院，吉林長春130021；3.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院檢驗科，吉林長春130033)

子宮內(nèi)膜容受性(endometrial receptivity, ER)是指子宮內(nèi)膜接受胚胎的能力，胚胎的植入嚴格受到時間和空間的限制。子宮內(nèi)膜在激素的作用下，需調(diào)整到可允許胚胎黏附以及植入的狀態(tài)，這一時期被稱為“種植窗期”(window of implantation，WOI)，在排卵后第6～8天，或28天月經(jīng)周期中的第20～24天，種植窗期持續(xù)約48 h，是子宮內(nèi)膜做好準備成功接納胚泡的階段[1]。ER在卵巢激素的作用下，與下丘腦激素、細胞因子和免疫細胞所分泌的因子等共同形成子宮內(nèi)膜的微環(huán)境，在多種因素相互影響作用下建立了子宮內(nèi)膜容受性。人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG) 在眾多可對胚胎植入過程產(chǎn)生重要影響的因素中，是最為重要的物質(zhì)分子信號之一[2]?？姑缋帐瞎芗に?AMH)是由卵巢顆粒細胞分泌的二聚體糖蛋白，通過其二型受體AMHR2發(fā)揮作用，可通過其反映卵巢的儲備功能，但其與子宮內(nèi)膜容受性的相關機制尚不清楚。本研究主要探討hCG、AMH及其受體在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性功能中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器和實驗材料

細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；7500 Fast型熒光定量PCR儀(ABI公司)；化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(天能公司)。

DEME/F12培養(yǎng)基(HyClone公司)；胰蛋白酶(HyClone公司)；胎牛血清(Corning公司)；人重組hCG(美國默克公司)；總RNA的TRIZOL試劑盒(全式金生物公司)；熒光定量PCR試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega 公司)；RIPA試劑(碧云天公司)；鼠抗人GAPDH單克隆抗體，兔抗人AMHR2多克隆抗體(Santa Cruz生物技術(shù)公司)；辣根過氧化物酶標記的二抗(Santa Cruz公司)；ECL化學發(fā)光顯影液(達科為公司)。

1.2 臨床資料

所有研究對象在進入助孕治療周期后，行子宮內(nèi)膜淺表機械刺激并留取子宮內(nèi)膜組織標本。均采用一次性子宮內(nèi)膜取樣器，在消毒外陰以及陰道后使用一次性宮腔組織吸引管探入子宮底部負壓抽取少量子宮內(nèi)膜于無菌管中。排除標準：基礎內(nèi)分泌異常；B超檢測子宮內(nèi)膜有異常回聲；染色體異常及傳染病活動期等。本研究已通過吉林省人民醫(yī)院倫理委員會審核，患者已簽署知情同意書。

1.3 細胞培養(yǎng)及處理

將子宮內(nèi)膜組織剪碎后，用胰酶進行消化，37℃消化30 min后，進行離心和洗滌，分離得到原代人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞[3]。將子宮內(nèi)膜原代細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清，1%抗生素DEME/F12培養(yǎng)基,將其放入37℃，5% CO2的孵箱中培養(yǎng)3天，隔天換液，觀察細胞生長情況及形態(tài)。待細胞生長良好，鋪滿10 mm平皿，將細胞用胰蛋白酶消化下來以分離細胞，將其平鋪于6孔板中，編號1～6。實驗組(1～3孔)用人促絨毛膜性腺激素處理(100 ng·mL-1)細胞，對照組(4～6孔)加入同體積的PBS(磷酸鹽緩沖液)。處理24 h后收集細胞，重復3次做提取RNA及提取蛋白的實驗。

1.4 熒光定量PCR測定

用TRIZOL方法將試劑加入待處理的細胞中，提取總RNA，IMPLEN機器檢測RNA濃度，用Promega試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA。進行熒光定量PCR反應。引物序列，AMHR2上游引物：GATTTGAGGCCTGACAGCA；下游引物：GCCAGGTGGATGGGTGTAG；18S上游引物：CATTCGAACGTCTGCCCTAT，下游引物：GATGTGGTAGCCGTTTCTCA。反應條件：94℃ 5 min；94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)40次；72℃ 10 min。計算基因表達水平的差異采用2-△△CT方法。

1.5 蛋白免疫印跡分析法檢測AMHR2的表達

用RIPA試劑提取蛋白，進行SDS-PAGE凝膠電泳，采用半干轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，在室溫條件下脫脂牛奶封閉2 h，與鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶1000)，兔抗人AMHR2單克隆抗體(1∶1000)，4℃孵育過夜，漂洗后再與辣根過氧化物酶標記的二抗封閉2 h，最后采用ECL試劑盒顯影。

1.6 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均采用Graphpad prism 5軟件進行分析，采用均數(shù)±標準差(x±s)表示。組間差異比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 分離得到人子宮內(nèi)膜細胞

采集子宮內(nèi)膜標本，分離原代子宮內(nèi)膜細胞并進行傳代培養(yǎng)。通過細胞免疫化學染色，發(fā)現(xiàn)AMHR2在分離得到的原代子宮內(nèi)膜細胞中有表達(圖1)。

圖1 原代子宮內(nèi)膜細胞中表達AMHR2

2.2 重組hCG對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞AMHR2基因表達影響

用人促絨腺素hCG(100 ng·mL-1)處理原代子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞24 h，提取RNA，通過熒光定量PCR實驗。與對照組相比，處理后AMHR2基因表達水平增加2.5倍，結(jié)果有統(tǒng)計學意義(n=6，P<0.01)。

2.3 重組hCG對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞AMHR2蛋白表達影響

用人促絨腺素hCG(100ng·mL-1)處理原代子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞24 h，提取蛋白進行SDS-PAGE電泳，通過免疫印記雜交實驗，檢測AMHR2表達水平。與空白對照組相比，AMHR2蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)，見圖2。

圖2 hCG對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞AMHR2表達的影響

3 討論

提高不孕癥患者妊娠率是臨床生殖醫(yī)學亟待解決的問題，著床期子宮內(nèi)膜對胚胎的容受性是影響妊娠率的一個重要原因[4]。正確評價子宮內(nèi)膜容受性，并對其進行合適的臨床處理，是提高妊娠率的關鍵，治療方法有待于不斷總結(jié)和提高。我們研究AMHR2與子宮內(nèi)膜容受性的相關性，探討AMH及其受體參與調(diào)節(jié)子宮“種植窗”過程中發(fā)揮的作用，具有一定的臨床應用價值。重組hCG在促進排卵、胚胎發(fā)育、種植和胎盤形成過程中具有重要作用，還能夠維持早期妊娠黃體功能[5]。近年來，有研究在子宮內(nèi)膜組織中定位了hCG受體/LH受體，并對其功能進行研究，發(fā)現(xiàn)hCG可由植入宮腔的胚胎分泌，能夠影響子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞和腺上皮的功能，通過旁分泌與自分泌的方式影響細胞因子的分泌及胚胎種植[6-7]。在建立子宮內(nèi)膜容受性和胚胎著床的過程中，hCG起著不可或缺的作用，能夠促進子宮內(nèi)膜血管形成，啟動和調(diào)控絨毛的侵襲性，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜中免疫耐受環(huán)境[8]。目前，臨床上使用hCG肌注或?qū)m腔灌注的方法，改善子宮內(nèi)膜容受性、促進胚胎種植，但是其機制還不十分清楚[9-11]。還有一些研究表明，在體外受精—胚胎移植時，在胚胎移植前進行宮腔內(nèi)灌注hCG，可大大提高種植率和妊娠率，這進一步印證了hCG可以一定程度地改善子宮內(nèi)膜容受性[12-13]。

本實驗中，我們分離得到人子宮內(nèi)膜細胞，并檢測到AMHR2表達于人子宮內(nèi)膜細胞。體外實驗表明，hCG能夠顯著提高間質(zhì)細胞AMHR2基因和蛋白的表達水平，由此可以推測hCG在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性能中具有重要作用。但是目前國內(nèi)外對于子宮內(nèi)膜中hCG/LH受體的研究較少，而且現(xiàn)今提高IVF-ET妊娠率的一個關鍵的環(huán)節(jié)即子宮內(nèi)膜容受性的改善，hCG對提高子宮內(nèi)膜容受性的效果是近年來的研究熱點，因此深入研究hCG對子宮內(nèi)膜容受性改善的分子機制具有重要意義。