曹 藍(lán)，李魁彪，魯恩潔，陳藝韻，劉艷慧，夏 丹，狄 飚

禽流感病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒，根據(jù)病毒表面抗原血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同，分為不同亞型：H1～H16，N1～N9[1]。H6亞型禽流感病毒屬于低致病性禽流感病毒，禽類感染后常表現(xiàn)為輕微臨床癥狀或無臨床癥狀。1965年首次從火雞體內(nèi)分離到H6亞型禽流感病毒以來，該亞型病毒不斷地在野禽和家禽體內(nèi)分離到。研究顯示，我國早期H6亞型禽流感病毒主要為H6N1和H6N2[2]，近期主要流行亞型為H6N6和H6N2[3]，同時其流行和傳播呈上升趨勢，是我國南方地區(qū)家禽常見的禽流感病毒亞型之一[4]。一方面H6亞型禽流感病毒可以為人感染H5亞型禽流感病毒提供基因骨架，進(jìn)而增加禽流感病毒跨物種傳播風(fēng)險[5]，另一方面H6亞型禽流感病毒可以直接感人，具有突破種間屏障而感染哺乳動物甚至感染人的潛能[6]。當(dāng)前我國家禽中H6與H5、H7、H9亞型共流行，增加了不同禽流感病毒重組的復(fù)雜性。研究發(fā)現(xiàn)，HA蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)變異在禽流感病毒跨宿主傳播中發(fā)揮了重要作用[6]。本研究以廣州地區(qū)2016-2018年外環(huán)境監(jiān)測分離的H6亞型禽流感病毒為研究對象，分析HA基因變異和進(jìn)化特點(diǎn)，進(jìn)而監(jiān)測廣州地區(qū)H6亞型禽流感病毒跨物種傳播風(fēng)險。

1 材料與方法

1.1樣本來源 根據(jù)廣州市外環(huán)境禽流感病毒監(jiān)測方案，在禽類生鮮市場、活禽肉菜市場、批發(fā)市場、家禽規(guī)模養(yǎng)殖場(戶)或散養(yǎng)戶集中地區(qū)和野生禽鳥棲息地等五類場所中，隨機(jī)選取糞便、飲水、污水、籠具、刀具、地面、稱、脫毛機(jī)等不同類型外環(huán)境標(biāo)本并于4 ℃保存，在24 h內(nèi)送至實驗室于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?016-2018年的監(jiān)測標(biāo)本中有6份標(biāo)本經(jīng)熒光定量RT-PCR檢測為A型、H6亞型禽流感病毒陽性，H5、H7和H9亞型禽流感病毒陰性，檢測試劑盒購于江蘇碩世生物科技股份有限公司。

1.2病毒分離 陽性標(biāo)本進(jìn)行10 000 g離心2 min后取上清，抗生素處理后接種9～10 d齡SPF雞胚。37 ℃培養(yǎng)2～3 d后，收獲接胚尿囊液，通過血凝實驗記錄病毒滴度，血凝陽性毒株再一次經(jīng)熒光定量RT-PCR檢測為A型、H6亞型禽流感病毒陽性，H5、H7和H9亞型禽流感病毒陰性。

1.3序列測定 應(yīng)用Oligo 6軟件設(shè)計H6亞型禽流感病毒HA基因全長擴(kuò)增引物，引物由華大基因合成。通過RT-PCR方法擴(kuò)增HA基因，將陽性鑒定產(chǎn)物送至廣州華大基因公司，通過ABI 3730進(jìn)行病毒基因一代測序。

1.4序列分析 以2013年臺灣分離的人源毒株A/Taiwan/2/2013(H6N1)和近年H6亞型病毒流行株HA基因作為比較基因，應(yīng)用DNA Star7.1軟件拼接HA基因序列并對序列進(jìn)行同源性分析，用MegAlign軟件比對受體結(jié)合位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)變異情況。使用MEGA 4.0軟件，以HA基因ORF(Open Reading Frame)為基本單元，從GISAID(Global Initiative on Sharing All Influenza Data)數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)參考序列，繪制HA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。繪制方法為Neighbor-joining法(參數(shù)設(shè)置為1 000 replications)及Maximum composite likelihood model比對核苷酸序列。

2 結(jié) 果

2.1同源性分析 6株病毒HA基因核苷酸同源性在81.0%～99.1%之間，分離株HA蛋白氨基酸同源性在81.3%～99.4%之間，分離株核苷酸最大相似性毒株見表1。

表1 2016-2018年廣州H6亞型禽流感病毒HA基因最大相似性毒株
Tab.1 Viruses of maximum similarity with HA gene of H6 subtype avian influenza viruses in Guangzhou from 2016 to 2018

毒株名稱最大相似性毒株相似度/%A/environment/2016B1395/2016A/duck/Jiangxi/262/2013(mixed)97A/environment/2017NX25557/2017A/duck/Ganzhou/GZ151/2016(H6N6)99A/environment/2018XN03891/2018A/duck/Ganzhou/GZ151/2016(H6N6)98A/environment/20180467/2018A/duck/Ganzhou/GZ151/2016(H6N6)98A/environment/20180518/2018A/duck/Ganzhou/GZ151/2016(H6N6)98A/environment/2018XN13565/2018A/pigeon/Guangxi/158/2014(H6N2)97

2.2分子特征分析 有研究表明，HA裂解位點(diǎn)附近具有4個以上連續(xù)的堿性氨基酸插入是高致病性禽流感病毒重要的分子標(biāo)志[7]，本研究的6株毒株的裂解位點(diǎn)位于第345位和第346位氨基酸之間，且裂解位點(diǎn)序列相對保守，沒有出現(xiàn)變異，只在第345位有1個堿性氨基酸，呈現(xiàn)為低致病性禽流感病毒分子特點(diǎn)。HA蛋白第226位和228位是禽流感病毒重要的受體結(jié)合位點(diǎn)，本研究中6株毒株均為226Q和228G，即傾向與禽類呼吸道細(xì)胞受體結(jié)合，此外A/environment/2018XN13565/2018毒株出現(xiàn)E190T變異。H6亞型禽流感病毒HA蛋白共有8個糖基化位點(diǎn)，其中A/environment/2016B1395/2016毒株在183位出現(xiàn)糖基化位點(diǎn)缺失，詳見表2。

表2 2016-2018年廣州H6亞型禽流感病毒HA基因分子特征
Tab.2 Molecular characteristics of HA gene of H6 subtype avian influenza viruses in Guangzhou from 2016 to 2018

毒株編號裂解位點(diǎn)受體結(jié)合位點(diǎn)糖基化位點(diǎn)340-3481861902262282627391833073124995582016B1395---E---L-PEQGNNSNSTNVY-NKT NVSNGTNGS2017NX25557---E---L-PEQGNNSNSTNVYNNTNKT NVSNGTNGS2018XN03891---E---L-PEQGNNSNSTNVYNNTNKT NVSNGTNGS20180467---E---L-PEQGNNSNSTNVYNNTNKT NVSNGTNGS20180518---E---L-PEQGNNSNSTNVYNNTNKT NVSNGTNGS2018XN13565---E---L-PTQGNNSNSTNVYNCTNKT NVSNGTNGSA/Taiwan/2/2013---A---I- LVQSNNSNSTNVYNNTNKT NVSNGTNGS

2.3遺傳進(jìn)化分析 本研究中2016-2018年5株毒株歸屬于歐亞譜系內(nèi)的ST2853-like分支，該分支內(nèi)流行毒株分離地的不同，又形成2個小分支，其中A/environment/2016B1395/2016毒株與華東地區(qū)流行毒株親緣關(guān)系相近，其余4株毒株與華南地區(qū)流行毒株親緣關(guān)系相近。而2018年另有一毒株(A/environment/2018XN13565/2018)歸屬于歐亞譜系內(nèi)的ST339-like分支，見圖1。

注：“●”代表2016-2018年廣州外環(huán)境分離株；“■”代表不同進(jìn)化分支代表株；“◆”代表人源毒株圖1 2016-2018年廣州H6亞型禽流感病毒HA基因遺傳進(jìn)化分析Fig.1 Genetic evolution analysis of HA gene of H6 subtype avian influenza viruses in Guangzhou from 2016 to 2018

3 討 論

1997年出現(xiàn)首例人感染H5N1禽流感病例，研究發(fā)現(xiàn)H6N1的7個基因片段與該H5N1病毒高度同源，推測H6N1是H5N1的前體病毒，而同樣在2014年我國四川出現(xiàn)的首例人感染H5N6禽流感病例中發(fā)現(xiàn)，H5N6病毒NA基因即是與H6N6病毒重組而來[8]，提示說明H6亞型禽流感病毒可以通過重組而增加病毒的跨物種傳播風(fēng)險，以及H6亞型禽流感病毒與H5亞型禽流感病毒之間發(fā)生自然重組的普遍性，推測H5Nx流行株的 NA亞型與H6Nx的NA亞型流行有關(guān)。因此當(dāng)前流行的H5N6病毒，是否會繼續(xù)以H6Nx為病毒骨架，進(jìn)一步重組產(chǎn)生新型H5Nx病毒，需要特別關(guān)注?；钋菔袌鍪乔萘鞲胁《玖餍泻蛡鞑サ闹匾獔鏊?，Peng等[9]監(jiān)測研究顯示，2012-2016年我國家禽中H6亞型禽流感病毒的流行呈上升趨勢。因此開展H6亞型禽流感病毒流行情況及其NA亞型分布情況監(jiān)測，對監(jiān)測新型H5Nx的出現(xiàn)及禽流感病毒跨種間傳播具有一定的預(yù)警意義。

早在2009年的研究報道顯示，H6亞型禽流感病毒可以人工感染小鼠和雪貂[10-11]，2011年我國廣東分離到豬源H6N6禽流感病毒[12]，特別是2013年臺灣報道了首例人感染H6N1禽流感病毒病例[13]，血清學(xué)研究也顯示，2007年在廣西健康人群中檢測到了H6亞型禽流感病毒抗體[14]，上述研究均提示H6亞型禽流感病毒具有突破種間屏障直接感染哺乳動物甚至感染人的潛能，這對公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重威脅。進(jìn)一步研究顯示，HA蛋白G228S突變增加了H6N1禽流感病毒與人唾液酸受體的結(jié)合能力，這是H6亞型禽流感病毒感染人的重要分子基礎(chǔ)[6]，此外也與HA蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)P186L突變有關(guān)。本研究中，2016-2018年分離株HA基因與人源A/Taiwan/2/2013(H6N1)毒株同源性差異較大(核苷酸同源性在82.8%～83.4%之間)，基因比對顯示大部分分離株與廣東地區(qū)H6N6亞型禽源病毒基因相似度最高。但2016-2018年廣州分離株之間同源性差異也變化較大，最大同源性高達(dá)99.1%，最小同源性僅為81.0%，說明雖然近年來廣州地區(qū)H6毒株尚為禽源本地化病毒，也未監(jiān)測到與2013年臺灣人源H6N1病毒基因同源的相似病毒存在，但HA基因已出現(xiàn)較大變異，提示持續(xù)開展H6亞型禽流感病毒基因進(jìn)化監(jiān)測的必要性。

進(jìn)化分析上，廣州H6亞型禽流感病毒環(huán)境分離株與人源A/Taiwan/2/2013(H6N1)位于不同進(jìn)化分支。2018年之前廣州分離株遺傳進(jìn)化上相對單一，均屬于ST-2853 like流行分支，與以往報道一致[15-16]，但由于禽流感病毒基因變異較快，在ST-2853 like分支內(nèi)，2016年毒株與華東地區(qū)流行毒株親緣較近，2017-2018年毒株與華南地區(qū)流行毒株親緣較近，出現(xiàn)一定的進(jìn)化差異。從2018年開始，廣州分離株保持在ST2853-like分支繼續(xù)進(jìn)化的基礎(chǔ)上，又出現(xiàn)ST339-like新流行分支病毒。

基因分子變異上，H6亞型禽流感病毒HA蛋白只有1個堿性氨基酸插入，屬于低致病性禽流感病毒，雖對禽類呈現(xiàn)低致病性，但臨床癥狀上難于發(fā)現(xiàn)，更有利于病毒的潛在傳播，提示未來一段時間H6亞型禽流感病毒仍然是活禽市場常見流行的禽流感病毒亞型之一。本研究毒株中HA蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)相對保守，尚未出現(xiàn)重要變異，為典型的禽類受體位點(diǎn)特點(diǎn)，推測發(fā)生跨種間傳播的風(fēng)險較低。

利益沖突：無