羅 波，李 想，周必英

豬囊尾蚴病又稱豬囊蟲病(Cysticercosis)，是由豬帶絳蟲(Taeniasolium,Ts)的中絳期幼蟲——囊尾蚴(Cysticercuscellulosae)感染人或豬引起的一種嚴重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類健康的人獸共患寄生蟲病。豬帶絳蟲成蟲寄生于人體小腸，當孕節(jié)或蟲卵隨宿主糞便排出體外，被中間宿主人或豬吞食后，在其小腸內(nèi)孵出六鉤蚴，鉆入腸壁，經(jīng)血循環(huán)及淋巴系統(tǒng)到達腦、眼、皮下、肌肉等部位，逐漸發(fā)育為囊尾蚴引起囊蟲病，寄生于人腦引起的腦囊蟲病約占人體囊蟲病的80%以上，具有極高的致殘率與致死率[1-2]。該病呈全球性分布，國外主要流行于亞洲、非洲和拉丁美洲等一些國家和地區(qū)，在我國主要以東北、華北、西北和西南等地人群發(fā)病率較高，其中貴州黔東南的凱里、從江，黔南的都勻、羅甸和黔西南的冊亨等縣(市)為少數(shù)民族聚居區(qū)，是豬帶絳蟲/囊蟲病的潛在流行區(qū)，主要與不良飲食衛(wèi)生習慣和生豬飼養(yǎng)方式不當有關(guān)[3-5]。

國內(nèi)外學者對豬帶絳蟲生活史不同發(fā)育階段的抗原分子進行了大量研究[6-11]。其中14-3-3蛋白是一類在真核細胞內(nèi)高度保守的酸性蛋白家族，廣泛參與寄生蟲細胞信號轉(zhuǎn)導、新陳代謝、生長發(fā)育、周期調(diào)控、細胞凋亡等多種重要的生命活動[12-15]。課題組前期研究證實，豬帶絳蟲14-3-3蛋白家族共有6個編碼基因，其編碼的蛋白分別歸屬于ζ、α、ε和γ亞型[16]，我們將其依次命名為Ts14-3-3.1、Ts14-3-3.2、Ts14-3-3.3、Ts14-3-3.4、Ts14-3-3.5和Ts14-3-3.6。在其它寄生蟲也發(fā)現(xiàn)有相似的蛋白亞型，如華支睪吸蟲14-3-3ε和陰道毛滴蟲14-3-3α[17-18]，都具有較好的抗原性。本研究擬利用大腸桿菌Arctic Express原核表達重組蛋白Ts14-3-3.3，將純化后的重組蛋白免疫新西蘭兔，制備多克隆抗體，觀察Ts14-3-3.3蛋白在豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴的分布情況，為進一步探究該蛋白的生物學功能及其作為囊蟲病免疫診斷抗原及疫苗候選抗原的潛力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1蟲體、質(zhì)粒與菌株 豬帶絳蟲成蟲和豬囊尾蚴由遵義醫(yī)科大學寄生蟲學教研室保存，質(zhì)粒pCznⅠ、大腸桿菌Top 10和Arctic Express由南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2主要試劑EasyPfuDNA Polymerase購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XbaⅠ、T4 DNA連接酶、RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自Takara公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；瓊脂糖凝膠電泳材料、氨芐青霉素(Amp)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、顯色劑購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白純化試劑盒HisLinkTMSpin Protein Purification System購自美國Promega公司；Protein A瓊脂糖純化樹脂購自生工生物工程(上海)股份有限公司；鼠源抗His單克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP購自南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司；羊抗鼠IgG-HRP購自美國CST公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；弗氏佐劑購自美國Sigma公司。

1.2 方 法

1.2.1引物設(shè)計與合成 根據(jù)豬帶絳蟲Ts14-3-3.3基因序列(登錄號：KF752476.1)設(shè)計特異性引物，F(xiàn)：5′-GGAATTCCATATGATGGCAGCTATTA-CTTCCT-3′(含NdeⅠ酶切位點)，R：5′-GCTCTAGATTAGGAGTCAGTTTCACATTC-3′(含XbaⅠ酶切位點)。引物由滁州通用生物公司合成。

1.2.2目的基因PCR擴增 按試劑盒說明書提取豬囊尾蚴總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以豬囊尾蚴cDNA為模板，F(xiàn)和R為引物進行PCR擴增，反應(yīng)體系50 μL：10×EasyPfuBuffer 5 μL；EasyPfuDNA Polymerase 1 μL；F、R各1 μL；cDNA模板2 μL；2.5 mmol/L dNTPs 5 μL；加ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其余產(chǎn)物按照凝膠回收試劑盒說明書進行回收純化。

1.2.3重組質(zhì)粒pCznⅠ-Ts14-3-3.3構(gòu)建與鑒定 利用NdeⅠ和XbaⅠ雙酶切純化的PCR產(chǎn)物及pCznⅠ載體，連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top 10感受態(tài)細胞，涂布于含Amp抗性的LB培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單個菌落進行PCR及酶切鑒定，最后測序驗證。

1.2.4Ts14-3-3.3重組蛋白的誘導表達、純化與鑒定 提取測序正確的陽性克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Arctic Express感受態(tài)細胞。挑取單個菌落，接種于含50 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)過夜，摸索不同終濃度的IPTG(0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L)、不同誘導時間(3 h、6 h、12 h)以及不同溫度(11 ℃、24 ℃、37 ℃)下對蛋白表達的影響，優(yōu)化出最佳誘導表達條件。離心收集菌體，超聲破碎后分別收集上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。Ts14-3-3.3重組蛋白的純化按照HisLinkTMSpin Protein Purification System試劑盒說明書操作，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及免疫印跡(Western blot)進行分析和鑒定。

1.2.5動物免疫與抗血清制備 將純化的Ts14-3-3.3重組蛋白與等體積的弗氏佐劑混勻后免疫新西蘭大白兔(皮下，400 μg/次)，共免疫3次(1次/ 2周)，末次免疫1周后頸動脈放血，收集血清，以Ts14-3-3.3重組蛋白包被酶聯(lián)板，間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測免疫后兔血清抗體效價。利用Protein A親和層析膠制備親和層析柱，將Ts14-3-3.3兔抗血清按1∶1稀釋后進行柱層析純化，待抗體結(jié)合后洗脫抗體，SDS-PAGE電泳檢測其純度。

1.2.6Ts14-3-3.3天然蛋白的Western blot分析 分別提取豬帶絳蟲成蟲和豬囊尾蚴的蟲體總蛋白，采用12% SDS-PAGE進行電泳，用濕轉(zhuǎn)方法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶37 ℃封閉后進行Western blot檢測。一抗為純化后的Ts14-3-3.3多克隆抗體(1∶1 000稀釋)，二抗為HRP標記羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)，DAB顯色后拍照，記錄結(jié)果。

1.2.7免疫組化 將豬帶絳蟲成蟲成節(jié)和囊尾蚴制成石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，置于檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中加熱至沸騰，重復蒸煮1～2次；滴加3% H2O2于切片上，室溫孵育10 min；以純化后的Ts14-3-3.3多克隆抗體為一抗(1∶400稀釋)，4 ℃過夜孵育；與二抗HRP標記羊抗兔IgG(1∶1 000稀釋)室溫下孵育1 h，DAB顯色，蘇木素-伊紅復染，每次反應(yīng)結(jié)束后需洗滌切片。梯度酒精脫水，中性樹膠封片，鏡檢。以免疫前兔陰性血清為對照，陽性反應(yīng)呈棕黃色顆粒。

2 結(jié) 果

2.1Ts14-3-3.3基因PCR擴增 以豬囊尾蚴cDNA為模板，F(xiàn)和R為引物，PCR擴增得到747 bp的Ts14-3-3.3目的基因片段(見圖1)，與預期大小一致。

M: DNA分子質(zhì)量標準; 1: Ts14-3-3.3基因PCR擴增產(chǎn)物圖1 Ts14-3-3.3基因PCR擴增Fig.1 PCR amplification of Ts14-3-3.3 gene

2.2重組質(zhì)粒pCznI-Ts14-3-3.3的鑒定 重組質(zhì)粒pCznI-Ts14-3-3.3經(jīng)NdeⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定后，得到4 400 bp的pCznI載體片段和747 bp的Ts14-3-3.3目的基因片段(見圖2)。測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒pCznI-Ts14-3-3.3構(gòu)建成功。

M1, M2: DNA分子質(zhì)量標準; 1: 酶切前質(zhì)粒pCznⅠ-Ts14-3-3.3; 2: 酶切后質(zhì)粒pCznⅠ-Ts14-3-3.3圖2 重組質(zhì)粒pCznⅠ-Ts14-3-3.3的雙酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme analysis of the recombinant plasmid pCznⅠ-Ts14-3-3.3

2.3Ts14-3-3.3重組蛋白的表達、純化和鑒定 重組質(zhì)粒pCznⅠ-Ts14-3-3.3經(jīng)11 ℃、0.5 mmol/L IPTG誘導12 h后，SDS-PAGE分析，在分子質(zhì)量約29.31 kD處出現(xiàn)明顯條帶(見圖3)，其分子質(zhì)量大小與預測分子量加上His標簽分子量的大小相符，說明該條帶為帶His標簽的Ts14-3-3.3目的蛋白。Ts14-3-3.3重組蛋白主要以可溶形式存在于菌體處理后的上清液中。將Ts14-3-3.3重組蛋白通過HisLinkTM親和層析柱純化，獲得了大小約29.31 kD的單一目的蛋白條帶(見圖4)。用Anti-His標簽抗體作為Western blot一抗，能夠識別表達的Ts14-3-3.3重組蛋白條帶(見圖5)，說明該蛋白攜帶有His標簽，進一步確認該條帶為Ts14-3-3.3目的蛋白條帶。

M: 蛋白分子質(zhì)量標準; 1: 誘導前; 2: 誘導后; 3: 誘導后破碎上清；4: 誘導后破碎沉淀圖3 Ts14-3-3.3重組蛋白的表達Fig.3 Expression of Ts14-3-3.3 recombinant protein

M: 蛋白分子質(zhì)量標準; 1: 超聲破碎后菌液; 2: 流出液; 3: 洗脫液圖4 Ts14-3-3.3重組蛋白的純化Fig.4 Purification of Ts14-3-3.3 recombinant protein

M: 蛋白分子質(zhì)量標準; 1: Ts14-3-3.3重組蛋白圖5 Ts14-3-3.3重組蛋白的Western blot鑒定Fig.5 Western blot identification of Ts14-3-3.3 recombinant protein

2.4免疫血清抗體效價及純度 間接ELISA法檢測結(jié)果顯示，經(jīng)純化的Ts14-3-3.3重組蛋白免疫后兔血清抗體效價為1∶512 000(見圖6)。純化后的Ts14-3-3.3多克隆抗體通過SDS-PAGE電泳觀察，結(jié)果顯示，55 kD和25 kD處出現(xiàn)抗體重鏈與輕鏈條帶，未發(fā)現(xiàn)雜蛋白(見圖7)，提示獲得了純度較高的Ts14-3-3.3多克隆抗體。

圖6 免疫血清的抗體效價Fig.6 Antibody titer of immunized serum

M: 蛋白分子質(zhì)量標準; 1: 純化后抗體圖7 純化抗體SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of purified antibody

2.5Ts14-3-3.3天然蛋白的Western blot分析 用制備的多克隆抗體對Ts14-3-3.3天然蛋白在豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴階段的表達進行Western blot分析，該多克隆抗體能與豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴Ts14-3-3.3天然蛋白在分子質(zhì)量約27.75 kD處發(fā)生反應(yīng)(見圖8)，證明在豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴階段均有Ts14-3-3.3蛋白表達，提示制備的Ts14-3-3.3多克隆抗體具有良好的特異性。

M: 蛋白分子質(zhì)量標準; 1: 豬囊尾蚴; 2: 豬帶絳蟲成蟲圖8 Ts14-3-3.3天然蛋白的Western blot分析Fig.8 Western blot analysis of Ts14-3-3.3 nature protein

2.6免疫組化 以Ts14-3-3.3多克隆抗體作為一抗，免疫組化分析結(jié)果顯示，該抗體能夠與豬帶絳蟲成蟲成節(jié)(見圖9 B1)和囊尾蚴(見圖9 A1)組織中的天然Ts14-3-3.3發(fā)生特異性結(jié)合，可見明顯增多的棕黃色顆粒，提示Ts14-3-3.3天然蛋白在豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴中均有表達。

A: 囊尾蚴; B: 成蟲; 1: 陽性血清; 2: 陰性血清圖9 Ts14-3-3.3天然蛋白的免疫組化分析(×200)Fig.9 Immunohistochemistry analysis of Ts14-3-3.3 nature protein(×200)

3 討 論

14-3-3蛋白是一類發(fā)現(xiàn)于牛腦神經(jīng)元蛋白的酸性蛋白家族，其命名來源于蛋白在DEAE-纖維素層析和凝膠電泳中的遷移位置[19]。該蛋白在物種間高度保守，廣泛參與生物體生命活動的調(diào)節(jié)，在細胞增殖、分化、衰老和凋亡過程中扮演重要角色[20-22]。研究表明，14-3-3β通過調(diào)控抑癌基因p53及其下游調(diào)控因子，能夠增強膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲能力，抑制其凋亡[23]。相反，14-3-3σ則保護細胞免受致瘤性轉(zhuǎn)化，在調(diào)節(jié)癌癥代謝重編程方面發(fā)揮重要作用[24]。在寄生蟲領(lǐng)域，14-3-3蛋白可以通過與乙酰膽堿受體(AChR)α4亞基之間的相互作用，動態(tài)調(diào)節(jié)細胞的穩(wěn)態(tài)水平，增強寄生蟲入侵宿主的能力[25]，調(diào)控寄生蟲的生長發(fā)育及形態(tài)學變化[15,26]。李宗吉等[27]利用細粒棘球絳蟲Eg14-3-3重組蛋白免疫小鼠，可誘導小鼠產(chǎn)生84.47%的保護率，能有效抵抗原頭節(jié)的攻擊感染，有望成為預防棘球蚴病的候選疫苗。

多克隆抗體具有制備簡單、特異性強、耗時短、免疫學研究用途廣等優(yōu)點，利用特異性抗體對重組蛋白進行免疫定位，是檢測蛋白在寄生蟲體內(nèi)表達與功能預測的常用方法[28]。研究表明，14-3-3蛋白在寄生蠕蟲體內(nèi)的定位與其參與蟲體生理調(diào)節(jié)、生長發(fā)育以及入侵宿主密切相關(guān)[29]。Zhang等[30]利用14-3-3小鼠抗血清成功識別出日本血吸蟲蟲卵、尾蚴以及童蟲階段的14-3-3天然抗原，表明該蛋白存在于日本血吸蟲生活史的各個階段。馮琳等[31]實驗結(jié)果顯示，在15 ℃和37 ℃條件下誘導出的重組蛋白均以包涵體形式存在，本試驗通過降低誘導溫度，采用相同體系對Ts14-3-3.3蛋白進行誘導表達，成功獲得了豬帶絳蟲可溶性重組蛋白Ts14-3-3.3，證實了低溫條件下獲得可溶性蛋白的概率較大。將重組蛋白純化后免疫新西蘭兔，能誘導1∶512 000的高效價特異性血清抗體，且該抗體可以識別豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴中的天然14-3-3.3蛋白，與吳冬麗等[32]結(jié)果一致，表明制備的多克隆抗體具有良好的特異性。本研究結(jié)果顯示Ts14-3-3.3蛋白在豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴組織中均有表達，進一步推測14-3-3蛋白可能參與豬帶絳蟲的生長發(fā)育過程，具有重要意義。就該蛋白如何參與調(diào)控豬帶絳蟲的生長發(fā)育以及致病機理，值得進一步研究。

本研究在前期獲得豬帶絳蟲14-3-3家族成員[16]的基礎(chǔ)上，利用基因工程技術(shù)成功制備了可溶性Ts14-3-3.3重組蛋白并獲得了多克隆抗體，為進一步研究該蛋白的生物學功能及其在囊蟲病診斷與疫苗研究中的價值奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突：無