張松，張麗，喬自林，王家敏，馬桂蘭，侯蘭新*

(1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030； 2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030； 3.蘭州民海生物工程有限公司，甘肅 蘭州 730010)

MDCK細(xì)胞系(Madin-Darby canine kidney cells，MDCK)是從母曲架犬腎組織中分離培養(yǎng)而獲得的上皮樣貼壁細(xì)胞，該細(xì)胞系可連續(xù)傳代[1]。MDCK細(xì)胞對各種流感病毒均較為敏感，已廣泛應(yīng)用于流感病毒的感染和檢測等領(lǐng)域[2]。人流感病毒主要通過與MDCK細(xì)胞上的受體結(jié)合感染細(xì)胞，但細(xì)胞表面的流感病毒受體的類型和數(shù)量存在著個體差異[3]，流感病毒在同種細(xì)胞不同個體的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制效率也存在高低差異。因此，通過有限稀釋法制備MDCK單克隆細(xì)胞庫，為篩選工作提供實驗細(xì)胞基礎(chǔ)顯得尤為重要。流感全稱為流行性感冒，是由流感病毒引起的一種呼吸道疾病[4]。流感病毒感染是由其表面的血凝素蛋白(HA蛋白)與宿主細(xì)胞膜表面上的糖鏈?zhǔn)荏w唾液酸(sialic acid，SA)共同介導(dǎo)而完成的，人流感病毒HA蛋白主要識別末端為唾液酸-α-2,6-半乳糖(SA-α-2,6-Gal)的糖鏈?zhǔn)荏w，其存在于人呼吸道上皮細(xì)胞表面[5]。接種流感疫苗被認(rèn)為是預(yù)防流感發(fā)生和流行的有效手段[6]。生產(chǎn)流感疫苗的傳統(tǒng)手段是利用雞胚培養(yǎng)系統(tǒng)，由于使用雞胚培養(yǎng)流感病毒常常會導(dǎo)致外源性污染、病毒變異、不同培養(yǎng)批次的流感病毒滴度不一致，因而難以迅速應(yīng)對流感大流行[7-8]。因此，急需開發(fā)一種可以大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗的理想的方法。采用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與流感病毒的生產(chǎn)結(jié)合被認(rèn)為是最具潛力的發(fā)展方向[9]。本研究擬采用有限稀釋法探索MDCK單克隆細(xì)胞株的最優(yōu)制備條件，提高MDCK單克隆細(xì)胞株的制備效率，為流感病毒的后續(xù)研究提供細(xì)胞資源和有價值的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 MDCK細(xì)胞系

MDCK細(xì)胞系購自ATCC(CCL-34)，由甘肅省動物細(xì)胞工程中心于-198 ℃液氮罐保存。

1.2 主要試劑

胎牛血清和新生牛血清均購自蘭州民海生物工程有限公司；DMEM培養(yǎng)基和0.25%胰酶均購自蘭州百靈生物技術(shù)有限公司；配制PBS(無Ca2+、Mg2+)緩沖液。

1.3 主要儀器設(shè)備

CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊公司)，生物倒置顯微鏡(日本奧林巴斯光學(xué)科技有限公司)，Countstar自動細(xì)胞計數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司)等。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將儲存于液氮罐中的MDCK工作庫細(xì)胞取出，37 ℃水快速融化后置于50 cm2培養(yǎng)瓶中，補加培養(yǎng)基后再置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待MDCK細(xì)胞生長至致密單層時，PBS液清洗，倒出PBS后加入5 mL 0.25%胰酶，緩慢搖動細(xì)胞培養(yǎng)瓶使胰酶充分沒過細(xì)胞表面，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)消化5 min，取出在顯微鏡下觀察。當(dāng)細(xì)胞全部變圓開始脫落時棄去胰酶，并在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)放置3 min，取出倒去胰酶加入15 mL DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞吹打混勻后按1∶4比例傳代，繼續(xù)將細(xì)胞放入37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗所獲數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件中的單因素方差分析和LSD法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清類型對制備MDCK單克隆細(xì)胞的影響

血清類型是影響制備MDCK單克隆細(xì)胞數(shù)的主要因素，胎牛血清制備的單克隆細(xì)胞數(shù)為(9.50±0.19)，明顯高于新生牛血清(5.25±0.56)。

2.2 血清類型對MDCK單克隆細(xì)胞株狀態(tài)對比

觀察MDCK單克隆細(xì)胞在胎牛血清和新生牛血清中的生長形態(tài)，不同血清培養(yǎng)的MDCK單克隆細(xì)胞在形態(tài)和生長特性方面沒有很大差異，均呈典型多角上皮樣形態(tài)(圖1)。但細(xì)胞在不同的血清培養(yǎng)條件下生長狀態(tài)不同，胎牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞生長速度較新生牛血清快。同傳代比例生長48 h，胎牛血清培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞匯合度可以達到95%，而新生牛血清培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞匯合度只有80%。表明胎牛血清在MDCK細(xì)胞的體外增殖過程中，可使細(xì)胞增殖更加活躍。胎牛血清培養(yǎng)的MDCK單克隆細(xì)胞，長滿單層后均勻分布，細(xì)胞胞質(zhì)豐滿，核仁清晰。新生牛培養(yǎng)上清液較胎牛血清上清液渾濁，細(xì)胞上清液中細(xì)胞出現(xiàn)脫壁現(xiàn)象，死亡細(xì)胞增多。因此，用胎牛血清制備的MDCK單克隆細(xì)胞生長狀態(tài)更好。

圖1 胎牛血清與新生牛血清制備MDCK單克隆細(xì)胞株狀態(tài)對比

2.3 胎牛血清濃度對制備MDCK單克隆細(xì)胞的影響

胎牛血清濃度和單孔理論接種密度是影響有限稀釋法制備MDCK單克隆細(xì)胞效率的主要因素。實驗結(jié)果表明，15%胎牛血清的單克隆細(xì)胞數(shù)為(7.38±0.65)，高于10%胎牛血清的單克隆細(xì)胞數(shù)(5.75±0.65)，有助于制備更多的MDCK單克隆細(xì)胞；單孔理論細(xì)胞密度值為1個·孔-1時，制備的MDCK單克隆細(xì)胞數(shù)為(9.50±0.19)，極顯著高于0.5個·孔-1(8.00±0.01)和2個·孔-1(3.50±0.57)2個密度(P<0.01)。

3 討論

流感對人類健康威脅嚴(yán)重，其發(fā)病率為各種傳染性疾病之首，是嚴(yán)重危害人類健康的重要傳染病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，全球每年約有6億～l2億人感染流感，其中死亡人數(shù)高達50萬～100萬人，給人類健康和經(jīng)濟造成了巨大危害和損失。特別是近年來人感染高致病性H5N1禽流感，以及2009年在墨西哥暴發(fā)的甲型H1N1流感，再一次給人們敲響了警鐘，人類流感的防控極為重要。流感病毒表面抗原時常發(fā)生變異[11]，及時接種疫苗是預(yù)防流感最有效的方法。目前，流感疫苗的主要生產(chǎn)介質(zhì)是雞胚，然而由雞胚來源的疫苗存在著質(zhì)量難以控制、生產(chǎn)周期長、易引起過敏等問題，一旦流感暴發(fā)，其來源將成為瓶頸，無法及時應(yīng)對流感疫情。因此，開發(fā)新的人用流感疫苗生產(chǎn)介質(zhì)已成為疫苗生產(chǎn)的關(guān)鍵，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦細(xì)胞是生產(chǎn)疫苗的優(yōu)良介質(zhì)。MDCK細(xì)胞系是1958年Madin等從美國一頭Cocker Spanie母曲架犬的腎臟組織中分離培養(yǎng)建立得到的細(xì)胞[12]。該細(xì)胞形態(tài)呈上皮細(xì)胞樣，貼壁生長，可連續(xù)傳代，具有易培養(yǎng)、增殖快、流感病毒感染效率高等特點，被用作流感病毒疫苗生產(chǎn)的重要細(xì)胞系。

牛血清是生物醫(yī)藥領(lǐng)域公認(rèn)的培養(yǎng)細(xì)胞的一種重要原料，含有豐富的細(xì)胞生長必需的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、激素、生長因子、貼壁因子和多肽類物質(zhì)等[13-14]，支撐著細(xì)胞的生長和正常增殖，為順利進行細(xì)胞體外培養(yǎng)提供了必要的營養(yǎng)保障[15-16]。我國使用最多的是胎牛血清和新生牛血清，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)是在屠宰懷孕母牛的時候，通過心臟穿刺采血獲取的胎牛血清；新生牛血清(newborn bovine serum，NBS)是指出生14 h內(nèi)未進食的健康新生牛采集分離的血清原料進一步精制而成[17]。胎牛血清絕大部分的物質(zhì)來源于母體,含有豐富的胚胎發(fā)育過程中必需的一些生長因子和激素等；新生牛血清的這些成分相對較少，隨著犢牛月齡的增長,血清中的抗體、補體等成分增加，而這些大分子蛋白質(zhì)是一種異源物質(zhì)，給細(xì)胞增殖帶來不利影響。大量的脂蛋白、纖維蛋白以及多肽類物質(zhì)在低溫保存解凍過程中會自然形成很多沉淀。有限稀釋法是一種單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，通過將細(xì)胞稀釋至每孔只有單個細(xì)胞后進行培養(yǎng)而獲得單克隆化細(xì)胞株的目的。該方法適用于細(xì)胞純化，突變細(xì)胞株的選擇和分離，是培養(yǎng)單克隆細(xì)胞株的常用方法[10]。一個細(xì)胞克隆株中的所有細(xì)胞均來源于同一個祖先細(xì)胞，故稱之為單克隆細(xì)胞(monoclonal cell)。本研究中新生牛血清培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有少量的雜質(zhì)懸浮于細(xì)胞液中，細(xì)胞貼壁后雜質(zhì)便貼附于細(xì)胞上，影響細(xì)胞的生長和單細(xì)胞孔的標(biāo)記。馬桂蘭等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)單克隆細(xì)胞時，細(xì)胞失去了群體效應(yīng)支持，生長變得艱難，使用胎牛血清的效果比新生牛的更好。血清的質(zhì)量直接關(guān)系到研究進度和生產(chǎn)效益，血清選擇不當(dāng)可能會造成細(xì)胞增殖緩慢甚至導(dǎo)致細(xì)胞不增殖，推遲科研進度，導(dǎo)致不必要的損失。因此，研究不同血清對有限稀釋法制備單克隆細(xì)胞的影響具有很重要的意義。本研究血清對比結(jié)果顯示，使用胎牛血清制備MDCK單克隆細(xì)胞對細(xì)胞生長狀態(tài)、生長速度及單細(xì)胞孔的標(biāo)記角度更加理想。

細(xì)胞培養(yǎng)中使用的血清濃度一般為0.5%～30%[19]。血清濃度過高會導(dǎo)致細(xì)胞生長過快，相悖于MDCK細(xì)胞的正常生長周期；濃度過低會導(dǎo)致細(xì)胞生長過慢甚至死亡[20]。馬萍等[21]研究表明胎牛血清含量為5%～15%時，MDCK細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞均能長成片。MDCK細(xì)胞在不同濃度的胎牛血清下生長趨勢也有很大不同。本研究顯示，MDCK細(xì)胞在低濃度血清培養(yǎng)條件下生長狀態(tài)不佳。因此，設(shè)定10%和15% 2個胎牛血清濃度，探究其與制備MDCK單克隆細(xì)胞效率的相關(guān)性，結(jié)果表明血清濃度與制備MDCK單克隆細(xì)胞效率二者之間高度相關(guān)，有限稀釋法利用15%胎牛血清濃度制備MDCK時效率明顯提升。單孔細(xì)胞濃度是影響有限稀釋法制備MDCK單克隆細(xì)胞株的重要因素。隨著單孔細(xì)胞濃度的升高，MDCK單克隆細(xì)胞制備效率呈現(xiàn)先上升后快速下降的趨勢。本研究結(jié)果顯示，單孔細(xì)胞濃度與制備單克隆細(xì)胞數(shù)目有正相關(guān)性，在1個·孔-1時，通過有限稀釋法制備的單克隆細(xì)胞數(shù)目最多，相比另外兩濃度具有明顯優(yōu)勢。與2個·孔-1的單孔細(xì)胞濃度相比，0.5個·孔-1單孔細(xì)胞濃度時制備MDCK單克隆細(xì)胞株在單孔標(biāo)記操作更加簡單快速，省時節(jié)力。

隨著利用細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)流感疫苗的研究熱度越來越高，高效制備MDCK單克隆細(xì)胞株也逐漸成為研究重點，可相關(guān)實驗參數(shù)條件均處于探索階段。本研究采用有限稀釋法制備MDCK單克隆細(xì)胞株，胎牛血清濃度為15%，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板單孔接種密度為1個·孔-1時，可以較高效制備MDCK單克隆細(xì)胞株。本研究建立的MDCK單克隆細(xì)胞庫為開展MDCK細(xì)胞及流感細(xì)胞基質(zhì)疫苗的研究提供了細(xì)胞資源，探究了有限稀釋法制備MDCK單克隆細(xì)胞的實驗參數(shù)條件，可為今后制備單克隆細(xì)胞并開展流感疫苗相關(guān)研究提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。