張?jiān)隽?，張迎龍，李?/p>

解放軍總醫(yī)院 第四醫(yī)學(xué)中心骨科，北京100048

骨肉瘤是一種惡性腫瘤，最常見于兒童和青少年四肢長(zhǎng)骨干骺端[1]。即使通過手術(shù)和新輔助化療，治療效果也只達(dá)60%～70%的生存率[2-4]，其中有轉(zhuǎn)移和化療耐藥的患者存活率很低[5]。因此，需要新的生物靶點(diǎn)或分子機(jī)制來提高骨肉瘤治療的療效。環(huán)狀RNA（circRNAs）具有保守性、穩(wěn)定性、差異性及豐富性等特征，是在臨床和醫(yī)學(xué)研究中得到廣泛認(rèn)可的一種有用的生物標(biāo)志物。circRNAs 可以充當(dāng)miRNA海綿，是一種競(jìng)爭(zhēng)miRNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA的新型內(nèi)源性RNA。隨著新一代測(cè)序和生物信息學(xué)分析的應(yīng)用，更多的研究發(fā)現(xiàn)circRNAs 參與多種疾病進(jìn)展，尤其是腫瘤的發(fā)生。研究報(bào)道，通過沉默circCMTM3（hsa_circ_0008450）可以調(diào)控miR-214-3p/EZH2 軸來抑制肝癌的進(jìn)展[6]；circCMTM3 還可以通過靶向miR-577 上調(diào)CXCL9的表達(dá)，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲[7]。本研究旨在探究circCMTM3在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況以及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

成骨細(xì)胞hFOB1.19，骨肉瘤細(xì)胞Huo9、G-292和Saos2 來自美國(guó)ATCC；pmirGLO 質(zhì)粒購(gòu)自上?？吕咨锟萍加邢薰?；pLCDH-ciR 載體購(gòu)自廣州吉賽生物科技有限公司；10%胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma 公司；miR-588 mimics 或siRNA 來自廣州市銳博生物科技有限公司；Lipo?fectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol 試劑盒購(gòu)自In?vitrogen 公司；CCK-8 試劑購(gòu)自GlpBio 公司；雙螢光素酶報(bào)告試劑盒購(gòu)自Promega 公司；Transwell 小室和Matrigel 基質(zhì)凝膠購(gòu)自BD 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR green PCR mix、96 孔板、流式細(xì)胞分析試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司；HRP 試劑、RIPA 緩沖液和PMSF 購(gòu)自Solarbio 公司；PVDF膜購(gòu)自Millipore 公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將circCMTM3的497 bp 序列長(zhǎng)度構(gòu)建至pLCDH-ciR 載體中，以空載體為對(duì)照，將載體分別轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞，利用嘌呤霉素篩選細(xì)胞。通過LipofectAMINE 2000將miR-588 mimics 或siRNA 轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞。

1.3 RNA 提取和qRT-PCR

TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用SYBR green PCR mix 進(jìn)行qRT-PCR。U6和肌動(dòng)蛋白（actin）分別為miRNA和mRNA的內(nèi)參。引物見表1。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以1.5×103/孔加入96 孔板，分別37℃恒溫培養(yǎng)24、48、72和96 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL的CCK-8 溶液，繼續(xù)37℃恒溫培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定D450nm值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、D450nm值為縱坐標(biāo)制作增殖曲線。

1.5 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

1.5.1 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn) 將直徑6.5 mm、孔徑8 μm的Transwell 小室放入24 孔板中，上室加入200 μL 濃度為2×103/mL的無血清單細(xì)胞懸液，下室加入500 μL 含20%血清的培養(yǎng)基為遷移趨化物，于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，PBS 清洗3 次，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的DAPI 染色，倒置顯微鏡拍照計(jì)數(shù)。

1.5.2 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn) 從-20℃取出Matrigel膠，4℃冷卻融化，并用4℃預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基按照1∶3的比例稀釋Matrigel 膠，將稀釋后的溶液加入上室，其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.6 細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè)

取2 mL 濃度為1×106/mL的細(xì)胞懸液接種于6 孔板，轉(zhuǎn)染siRNA。將細(xì)胞懸液離心后用70%酒精于-20℃固定24 h，隨后離心并加入RNaseA 去除RNA，再用碘化丙鈉（PI）在黑暗中染色30 min，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分布。

表1 qRT-PCR引物及序列

收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，制作單細(xì)胞懸液，離心去上清。加入預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞2 次，去上清，然后加入1 mL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。取100 μL 加入5 mL 培養(yǎng)管中，加入5 μL FITC 標(biāo)記的AnnexinⅤ和5 μL PI 混勻后室溫下避光孵育15 min，再加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液。流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.7 螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

用LipofectAMINE 2000 將含有野生或突變circCMTM3的pmirGLO質(zhì)粒和miR-588 mimic 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。48 h后，用雙螢光素酶報(bào)告試劑盒測(cè)定螢光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)以x±s表示，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。2組間差異采用t檢驗(yàn)，3 組及3 組以上采用方差分析。雙尾值P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circCMTM3在骨肉瘤細(xì)胞中的高表達(dá)

在不同骨肉瘤細(xì)胞中檢測(cè)circCMTM3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)circCMTM3在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)量均高于正常成骨細(xì)胞中（圖1）。3種骨肉瘤細(xì)胞系中，G-292細(xì)胞中的circCMTM3表達(dá)最高，因此選用G-292細(xì)胞進(jìn)行circCMTM3 功能檢測(cè)。

2.2 沉默circCMTM3 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

為了探究circCMTM3在骨肉瘤細(xì)胞中的功能，對(duì)G-292細(xì)胞進(jìn)行circCMTM3 沉默，隨后通過CCK-8和Transwell檢測(cè)，結(jié)果如圖2，circCMTM3沉默后，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力均明顯降低。該結(jié)果說明circCMTM3 參與骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程，發(fā)揮促癌作用。

2.3 沉默circCMTM3 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞周期和凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)circCMTM3 是否影響骨肉瘤細(xì)胞周期和凋亡情況。結(jié)果表明，circCMTM3表達(dá)降低使G1 期細(xì)胞增加，而S 期細(xì)胞減少，敲除circCMTM3 抑制了細(xì)胞周期進(jìn)展，但促進(jìn)了細(xì)胞凋亡（圖3）。這些結(jié)果顯示，circCMTM3 促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，并減少了細(xì)胞凋亡。

2.4 circCMTM3 是miR-588的miRNA海 綿

圖1 circCMTM3在骨肉瘤細(xì)胞Huo9、G-292、Saos2和成骨細(xì)胞hFOB1.19 中的表達(dá)

圖2 沉默circCMTM3 影響骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

研究表明circRNA 常作為miRNA海綿調(diào)控miRNA的表達(dá)，從而參與細(xì)胞功能。通過starBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了含有circCMTM3 結(jié)合位點(diǎn)的4 條miRNA，分 別 為miR-4701-5p、miR-588、miR-1224-5p和miR-577。圖4A 結(jié)果顯示，circCMTM3敲除對(duì)miR-588表達(dá)影響顯著，而對(duì)其他影響不大。為了進(jìn)一步驗(yàn)證circCMTM3和miR-588 兩者的靶向作用關(guān)系，我們通過螢光素酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-588 mimic 顯著降低了正常組（WT）螢光素酶活性，而對(duì)突變組（MUT）無影響（圖4C）。miR-588在骨肉瘤細(xì)胞中低表達(dá)（圖4D），與circ?CMTM3在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況相反。綜上，circCMTM3 是miR-588的miRNA海 綿。

2.5 circCMTM3 通過海綿miR-588 促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲

為了檢測(cè)miR-588在骨肉瘤中的功能以及對(duì)circCMTM3 功能的影響，我們通過過表達(dá)miR-588和/或circCMTM3 并檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)過表達(dá)circCMTM3 促進(jìn)了骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，單獨(dú)過表達(dá)miR-588 抑制了細(xì)胞的遷移和侵襲，而過表達(dá)circCMTM3 消除了miR-588 過表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用（圖5）。這些結(jié)果表明，circCMTM3在骨肉瘤細(xì)胞中通過調(diào)控miR-588 而起到促癌作用。

圖3 沉默circCMTM3 影響骨肉瘤細(xì)胞周期和凋亡

圖4 circCMTM3 是miR-588的miRNA海綿

圖5 circCMTM3 通過海綿miR-588 促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲

3 討論

circRNA 已被鑒定為包括癌癥在內(nèi)的不同類型疾病的新型生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。研究顯示circRNA在腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮十分重要的作用[8-10]。hsa_circ_0001361 通過miR-491-5p/MMP9 軸促進(jìn)膀胱癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]；hsa_circ_0078710 作為miR-31的海綿，促進(jìn)肝癌進(jìn)展[12]。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)circ_0008450在肝癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)高于相應(yīng)的非腫瘤組織和細(xì)胞系，且circ_0008450 高表達(dá)的患者具有嚴(yán)重的臨床特征，包括腫瘤大小和TNM 分期較高[13]。本研究結(jié)果表明circCMTM3 同樣在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)，circCMTM3的敲除顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲，并刺激了細(xì)胞凋亡。因此，circCMTM3在骨肉瘤中具有促癌作用。

circRNA 可以通過海綿miRNA間接發(fā)揮其生物學(xué)功能。例如，Li 等發(fā)現(xiàn)上調(diào)的circ_0016760可以通過miR-1287/GAGE1 軸促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)程[14]；circ-FOXP1 通過海綿化miR-875-3p和miR-421促進(jìn)肝癌進(jìn)展[15]。本研究中，我們通過starBase 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了可能被circCMTM3 海綿的miRNA分別為miR-4701-5p、miR-588、miR-1224-5p和miR-577，其中只有miR-588的表達(dá)顯著受circCMTM3影響。我們通過螢光素酶報(bào)告試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證circCMTM3 能夠靶向海綿miR-588。

Zhou 等[16]研究發(fā)現(xiàn)miR-588在胃癌中低表達(dá)且抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。Yu 等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-588在乳腺癌中也具有抗腫瘤作用，是治療乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示miR-588在骨肉瘤細(xì)胞中低表達(dá)，并通過回復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)過表達(dá)circCMTM3 促進(jìn)了骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，miR-588 過表達(dá)抑制了細(xì)胞的遷移和侵襲，而過表達(dá)circCMTM3 通過海綿作用抑制miR-588的功能。這些結(jié)果表明，circCMTM3的致癌作用部分依賴于其對(duì)miR-588的調(diào)節(jié)，circCMTM3/miR-588p 軸有助于骨肉瘤進(jìn)展。但miR-588的具體作用機(jī)制仍待進(jìn)一步探討。

綜上所述，circTMCM3在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并通過海綿miR-588 發(fā)揮致癌作用，這項(xiàng)研究可能為骨肉瘤提供新的潛在治療途徑。