李 倩，尹恬恬，胡宇辰，吳 景，張 敏，何 杰，

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院//中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院，安徽合肥230031；2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院西區(qū)//安徽省腫瘤醫(yī)院，安徽合肥230031）

膠質(zhì)瘤是大腦中最常見的原發(fā)性腫瘤，而膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是其惡性度最高的組織學(xué)類型。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自身較強的增殖能力和侵襲性是其成功治療的主要障礙。目前臨床采用手術(shù)、放療、化療和生物治療等綜合治療手段，但患者生存期改善不明顯，預(yù)后仍很差，中位生存期14月左右［1］。目前研究認(rèn)為，尋求特異性針對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖和侵襲機制的治療方案，將有可能遏制腫瘤的生長。近年相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA在多種腫瘤中存在顯著的表達(dá)改變，參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移、自噬及化療敏感性等生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)，在腫瘤的發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［2］，有可能成為在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲、預(yù)后的分子標(biāo)記物，將為臨床腫瘤的靶向治療提供依據(jù)。肝癌高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本（highly up-reglated in 1iver cancer，HULC）是LncRNA的一種，被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)［3-4］，但在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)狀況的報道甚少。本研究為了證實HULC在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的表達(dá)及對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長的影響，以沉默表達(dá)HULC的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SHG44為研究對象，采用CCK8、平板克隆、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡等實驗探討LncRNA HULC沉默表達(dá)對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SHG44增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SHG44（中國典型培養(yǎng)物保藏中心，中國），胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific，美國），NC、HULC-siRNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，中國），細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒（合肥新恩源生物技術(shù)有限公司，中國），吉姆薩染液（合肥新恩源生物技術(shù)有限公司，中國），Annexin V-488凋亡試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國），總RNA提取試劑盒（QIAGEN，德國），cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃，50 mL/L CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期SHG44細(xì)胞，通過針對基因HULC的慢病毒干擾載體構(gòu)建、慢病毒包裝、病毒侵染、致死濃度及穩(wěn)篩株構(gòu)建，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的實驗組細(xì)胞株，即轉(zhuǎn)染HULC抑制劑的SHG44細(xì)胞為HULC干擾組（HULC-siRNA），轉(zhuǎn)染HULC抑制劑空白載體SHG44細(xì)胞為HULC干擾組的陰性對照組（NC），將實驗組細(xì)胞置于37℃，50 mL/L CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后傳代收集對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)檢測。

1.2.2 qRT-PCR實驗 消化收集細(xì)胞，按照總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，然后按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書制備cDNA反應(yīng)程序：42℃30 min；85℃10 min。再運行qRT-PCR反應(yīng)程序：95℃，變性3 min，40個擴增循環(huán)（95℃12 s，62 ℃ 40 s）。 HULC 引 物 上 游 序 列 ：5′-TCAACCTCCAGAACTGTGATCC-3′，下游序列：5′-TGCTTGATGCTTTGGTCTGTT-3′。以 ACTB 為內(nèi)參，ACTB引物上游序列：5′-CGTGGACATCCG CAAAGA-3′，下 游 序 列 ：5′-GAAGGTGGACAG CGAGGC-3’。以 2-ΔΔCt計算 HULC mRNA 的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)三次，并用GraghPad Prism 5軟件分析結(jié)果。

1.2.3 CCK8增殖實驗 消化收集對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，離心重懸后計數(shù)，調(diào)整濃度約2.0×104細(xì)胞/mL；準(zhǔn)備4塊96孔板，向每孔加入100 μL細(xì)胞懸液（每孔含2 000個細(xì)胞），每組細(xì)胞設(shè)6個復(fù)孔；在細(xì)胞樣本孔周圍一圈每孔加入200 μL PBS溶液，置于37℃，50 mL/L CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。次日，待細(xì)胞貼壁后取出第一塊96孔板，棄去原培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 100 mL/L CCK8液（將CCK8母液用完全培養(yǎng)基做10倍稀釋使用），置培養(yǎng)箱中孵育2 h后上酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度值（OD值），此為24 h OD值，其余各板每孔補加完全培養(yǎng)基 100 μL，并依次在 48 h、72 h 和96 h以同樣的方法檢測相應(yīng)的OD值。實驗重復(fù)三次，并用GraghPad Prism 5制作各組細(xì)胞上述四個時間點的生長曲線。

1.2.4 平板克隆形成實驗 消化收集對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，離心重懸后計數(shù)，以每孔300個細(xì)胞接種6孔板，每組細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔；每3～5 d換液，約10～12 d終止培養(yǎng)，40 mL/L多聚甲醛溶液固定30 min，吉姆薩染液染色8 min，清水洗去染液后晾干，顯微鏡下計數(shù)大于50個細(xì)胞的克隆數(shù)。克隆形成率（%）＝克隆數(shù)/實際接種細(xì)胞數(shù)×100%。實驗重復(fù)3次，并用GraghPad Prism 5軟件分析結(jié)果。

1.2.5 細(xì)胞周期實驗 消化收集對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS漂洗2次，加入500 μL PBS重懸后緩慢加入到5 mL 700 mL/L預(yù)冷乙醇中，于4℃固定過夜；次日取出固定后的細(xì)胞，以1000 r/min（r=6 cm）的速度離心3 min，棄去上清，用PBS輕柔漂洗1次，并用500 μL PBS重懸細(xì)胞，然后加入 10 μL RNase A（10 mg/mL），輕柔混勻后置于37℃溫箱孵育30 min，取出細(xì)胞并加入5 μL PI（100 μg/mL）染液，室溫避光孵育15 min，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況。實驗重復(fù)3次，并用FlowJo 7.6.1和GraphPad Prism 5軟件分析結(jié)果。

1.2.6 細(xì)胞凋亡實驗 用不含EDTA的胰酶消化、離心收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞終濃度為1×106/mL，預(yù)冷PBS漂洗2次，向細(xì)胞中加入100 μL鈣離子緩沖液輕柔吹打混勻制成單細(xì)胞懸液，先后加入5 μL Annexin V-488染液和5 μL PI染液，注意設(shè)置Annexin V-488和PI單染組和無染液的空白對照組，輕柔混勻，室溫避光孵育15 min，再加入500 μL鈣離子緩沖液重懸細(xì)胞，輕柔混勻后立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期凋亡率。實驗重復(fù)3次，用FlowJo 7.6.1和GraghPad Prism 5軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，兩組均數(shù)比較采用兩獨立樣本均數(shù)的t檢驗，P＜0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HULC沉默表達(dá)效果鑒定

將HULC抑制劑（HULC-siRNA組）及抑制劑空白載體（NC組）轉(zhuǎn)染SHG44細(xì)胞后，采用qRTPCR檢測HULC的表達(dá)，與NC組相比，轉(zhuǎn)染HULC-siRNA組的HULC表達(dá)水平顯著減少（圖1），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.616，P=0.003），說明實驗組細(xì)胞建立成功。

圖1 SHG44細(xì)胞的HULC沉默表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系表達(dá)水平驗證Fig.1 Verification of expression levels of HULC-silenced stably transfected cell lines in SHG44 cells

2.2 沉默表達(dá)HULC抑制SHG44增殖、促進(jìn)其凋亡

CCK8增殖實驗顯示實驗第2、3、4天HULC-siRNA組細(xì)胞OD450值明顯低于NC組（圖2A）；平板克隆形成實驗顯示NC組和HULC-siRNA組的克隆形成率分別為（34.11±1.24）%和（14.44±0.87）%，沉默表達(dá)HULC細(xì)胞克隆形成率顯著降低（圖2B）；細(xì)胞周期實驗顯示NC組和HULC-siRNA組的細(xì)胞數(shù)分別為：G1期（36.89±4.09、51.74 ± 0.68），S期（46.95 ± 2.49、36.89 ± 2.13），沉默表達(dá)HULC細(xì)胞周期被阻滯G1/S期（圖2C）；細(xì)胞凋亡實驗顯示NC組和HULC-siRNA組的早期凋亡率分別為（2.57±0.22）%和（7.06±0.71）%，沉默表達(dá)HULC細(xì)胞早期凋亡率顯著增加（圖2D）。上述實驗差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2A：第2天：t=6.616，P=0.003，第3天：t=19.93，P=0.005，第4天：t=31.41，P=0.009；圖2B：t=13.01，P＜0.001；圖 2C：G1期 t=3.577，P=0.023，S期 t=3.063，P=0.038；圖2D：t=6.045，P=0.004），說明HULC 沉默表達(dá)后可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展并促進(jìn)其凋亡。

3 討論

LncRNA是長度超過200個核苷酸的非編碼調(diào)控RNA，主要通過與其他分子（如蛋白質(zhì)，DNA，RNA和金屬離子）相互作用以形成適當(dāng)?shù)娜壗Y(jié)構(gòu)來發(fā)揮生物學(xué)功能。LncRNA影響各種生物學(xué)過程的基本分子機制，包括染色質(zhì)組織、表觀遺傳調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、RNA轉(zhuǎn)換和基因組防御等［5-7］。目前很多LncRNA被證實在多種腫瘤中存在顯著的表達(dá)改變，并參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移、自噬及化療敏感性等惡性生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)。LncRNA HULC位于人類基因組6p24.3，于2007年通過芯片篩查在肝癌中發(fā)現(xiàn)并命名［3］。但隨后被大量文獻(xiàn)陸續(xù)報道在胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、骨肉瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）等腫瘤中均有特異性高表達(dá)。文獻(xiàn)指出，HULC不僅在上述腫瘤的組織和細(xì)胞系中表達(dá)水平升高，而且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、患者預(yù)后及生存期等都呈顯著正相關(guān)［3-4，8-11］。如Jin等［12］發(fā)現(xiàn)HULC在胃癌血清中的過表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期和幽門螺桿菌感染有關(guān)。Peng等［8］使用qRT-PCR發(fā)現(xiàn)HULC在DLBCL組織和細(xì)胞系中均顯著過表達(dá)，且與DLBCL的Ann Arbor分期、B癥狀（發(fā)熱、盜汗、體質(zhì)量減輕）、CHOP方案治療、利妥昔單抗治療和國際預(yù)后指數(shù)（IPI）等密切相關(guān)。同時，有學(xué)者還指出，HULC的敲低可抑制腫瘤細(xì)胞的致瘤性［11］。如Uzan等［10］研究發(fā)現(xiàn)HULC在骨肉瘤（OS）組織和細(xì)胞系中與正常對照相比顯著上調(diào)，他們通過用小干擾RNA抑制HULC的表達(dá)進(jìn)行功能實驗，顯示細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力都明顯受抑制。但HULC在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況目前報道甚少，我們課題組前期實驗通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中HULC的表達(dá)水平明顯高于瘤旁組織，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中HULC高表達(dá)，并應(yīng)用膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U87進(jìn)行細(xì)胞功能實驗得出HULC過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的結(jié)論［11］。本實驗通過向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SHG44中轉(zhuǎn)染HULC抑制劑并以qRT-PCR驗證其表達(dá)被沉默，行功能實驗發(fā)現(xiàn)SHG44細(xì)胞的生長和增殖受到抑制，顯示HULC扮演著促癌基因的角色，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制癌細(xì)胞凋亡。

眾所周知，腫瘤是一種多基因疾病，其特征在于細(xì)胞生長的不受控制、細(xì)胞周期的失調(diào)以及對細(xì)胞凋亡的抵抗性。腫瘤細(xì)胞的命運取決于某些關(guān)鍵分子的表達(dá)，包括腫瘤抑制因子，致癌基因以及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子等。HULC作為促癌基因已在多種類型腫瘤中得到證實，對于其機制的研究在多種類型腫瘤中也具有多樣性。如在鼻咽癌中有學(xué)者發(fā)現(xiàn)沉默HULC表達(dá)后癌細(xì)胞周期被阻滯在G1期并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13］，機制是HULC的敲低觸發(fā)了p53的活化并誘導(dǎo)了p21的基因表達(dá)，p53和p21的表達(dá)被激活后引發(fā)了鼻咽癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡，指出沉默HULC表達(dá)后可通過激活p53-p21途徑顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力。Li等［14］等研究發(fā)現(xiàn)HULC和YB-1的亞細(xì)胞共定位，YB-1是被認(rèn)為是一種癌蛋白，調(diào)節(jié)多種增殖途徑，超越細(xì)胞周期檢查點，并促進(jìn)基因組不穩(wěn)定性、血管生成和轉(zhuǎn)移。所以他們指出HULC在肝癌中的促癌機制是與YB-1蛋白特異性結(jié)合并通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）加速其磷酸化，導(dǎo)致YB-1從YB1-mRNA復(fù)合物中釋放并促進(jìn)沉默mRNA的翻譯包括細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白E1和基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP3）。此外，他們的研究還顯示HULC可抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。目前在HULC對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤方面的機制研究也有報道，有學(xué)者認(rèn)為HULC通過調(diào)節(jié)作為Skp-1/2靶標(biāo)的細(xì)胞周期蛋白A/D1/E、p-Rb、c-Myc、CDK2/4和p16/p21/27的表達(dá)來誘導(dǎo)腫瘤增殖、遷移和細(xì)胞周期進(jìn)展，以及通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax和caspase-3/8的表達(dá)來誘導(dǎo)腫瘤失巢凋亡抵抗抑制細(xì)胞凋亡［15］。本實驗發(fā)現(xiàn)沉默表達(dá)HULC后SHG44的G1期明顯延長，阻斷了有絲分裂中的細(xì)胞，表明HULC通過促進(jìn)G1/S轉(zhuǎn)換增強細(xì)胞增殖，另外沉默表達(dá)HULC后SHG44細(xì)胞早期凋亡率升高，表明HULC促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們認(rèn)為HULC可能通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路阻斷細(xì)胞周期G1/S期并誘導(dǎo)失巢凋亡，從而影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生物學(xué)行為，有待下一步機制實驗驗證。

圖2 不同處理組SHG44細(xì)胞的增殖、周期分布及凋亡情況Fig.2 Proliferation，cycle distribution and apoptosis of SHG44 cells in different treatment groups

綜上所述，本實驗對HULC的初步了解提示HULC在膠質(zhì)瘤的發(fā)展中起著重要的作用，可能是會作為腫瘤的治療靶點和預(yù)后標(biāo)志物，為廣大臨床腫瘤患者的診治帶來福音，但目前研究尚淺。后期我們將進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)、體外研究，探討HULC對膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為的調(diào)控機制，為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床治療提供理論依據(jù)。