楊 靜，胡志琴，朱杰寧，李 暉，符永恒，袁淑菁，潘 蓉，張夢珍，單志新，

（1.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣東省人民醫(yī)院//廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院//廣東省心血管病研究所，廣東廣州510080；3.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510515）

在成人心臟中，心臟增大不是心肌細(xì)胞數(shù)量增加，而是單個心肌細(xì)胞的大小增加。心肌細(xì)胞肥大最初是對生理和病理刺激的適應(yīng)性反應(yīng)，但是病理性肥大通常發(fā)展為心力衰竭。由于病理性刺激（如壓力超負(fù)荷）引起的進(jìn)行性心臟肥大常與心力衰竭的發(fā)展相關(guān)，心力衰竭是全球發(fā)病率和死亡率的主要原因［1］。研究表明，以前未被認(rèn)識的機(jī)制，包括細(xì)胞代謝，增殖，非編碼RNA，免疫反應(yīng)，翻譯調(diào)控和表觀遺傳修飾，都會正向或負(fù)向調(diào)節(jié)心臟肥大［2］。microRNA（miRNA）是進(jìn)化上保守的非編碼RNA，長約22個核苷酸，其通過翻譯抑制或降解靶mRNA從而負(fù)向調(diào)節(jié)基因表達(dá)［3-4］。越來越多的證據(jù)表明miRNA廣泛參與心臟肥大的發(fā)病機(jī)制［4-7］。MiR-1通過靶向抑制許多信號分子，包括真核起始因子4E（Eif4e），Mef2a、Gata4、組蛋白脫乙酰酶6（HDAC6）和CDK6的翻譯來保護(hù)心臟結(jié)構(gòu)和功能以抑制心肌肥厚［8-11］。MiR-133a通過調(diào)節(jié)Akt及其下游信號分子如Cdc42、Rho-A和Nelf-A/WHSC2來減弱心肌肥厚［12］。MiR-10a和miR-497分別通過阻斷Tbx2和Sirt4的翻譯來發(fā)揮其抑制心肌細(xì)胞肥大作用［13-14］。我們的實(shí)驗證實(shí)miR-92b-3p通過靶向心肌細(xì)胞增強(qiáng)子2D（Mef2d）抑制心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生［15］。我們前期miRNA表達(dá)譜芯片檢測發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p在血管緊張素 II（Ang-II）誘導(dǎo)肥厚的小鼠心肌中表達(dá)顯著增強(qiáng)，但其對心肌肥厚的作用機(jī)制尚不明確。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)錄輔阻遏子 1（retinoblastoma transcriptional corepressor 1，Rb-1）作為腫瘤抑制蛋白，通過抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，阻止細(xì)胞過度生長直至細(xì)胞準(zhǔn)備分裂［16］。我們已證實(shí)cyclin/Rb-1信號通路激活介導(dǎo)了miR-16表達(dá)下調(diào)的促心肌細(xì)胞肥大作用［17］。本文利用乳小鼠心肌細(xì)胞，證實(shí)Rb-1是miR-199a-3p作用靶基因，并介導(dǎo)了miR-199a-3p的促小鼠心肌細(xì)胞肥大作用。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內(nèi)切酶XhoI、EcoRI、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、4 × SDS loading buffer（Invitrogen，Carlsbad，CA）；2 ×SYBR Green Mix、RNAase free water（TaKaRa，Japan）；miR-199a-3p mimic、Rb-1 siRNA（廣州銳博）；BCA蛋白定量試劑盒（Thermo Scientific，USA）；SDS-PAGE凝膠試劑盒（Thermo Scientific，USA）；抗 GAPDH、ACTA1，anti-Rabbit，antimouse抗體（Protein Technology，UK）；抗ANP抗體（Bioworld，USA）；抗β-MHC 抗體（Sigma，USA）；蛋白 Marker（invitrogen，USA）；PVDF膜（Millipore，USA）；ECL發(fā)光液（Millipore，USA）；Ang-II（Sigma，USA）；DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco，USA）；特級澳洲胎牛血清（Gibco，USA）。其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 乳小鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)及處理

取新生1～3 d的SPF級別C57BL/6乳鼠心臟（20只乳鼠/次，可鋪1板12孔板細(xì)胞），以2.5 g/L胰蛋白酶消化法原代分離細(xì)胞。乳鼠心肌細(xì)胞（neonatal mouse ventricular cardiomyocytes，NMVC）與成纖維細(xì)胞因貼壁速度不同而得以分離，收集上清液中心肌細(xì)胞，將其接種于提前用1%明膠包被過的12孔板中，加入含有100 g/L胎牛血清及100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，更換一次完全培養(yǎng)基至穩(wěn)定培養(yǎng)48 h。分別用100 nmol/L negative control、miR-199a-3p mimic和Rb-1 siRNA處理NMVC，24 h后結(jié)束實(shí)驗。

1.3 FITC-鬼筆環(huán)肽（FITC-phallodin）染色

將NMVC種在confocal皿中，穩(wěn)定生長后棄去培養(yǎng)基，用PBS漂洗兩次，加入500 μL的40 g/L的多聚甲醛溶液固定，再用2 mg/mL的甘氨酸溶液中和多聚甲醛，搖床孵育2次，每次5 min。將10 μg/mL的FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染料37℃孵育40 min，用PBS漂洗2次，再加Hoechst33342反應(yīng)液，避光37℃孵育40 min。將confocal皿倒扣于另一滴有30 μL防熒光淬滅封片劑的載玻片上，在倒置熒光顯微鏡下觀察F-actin被染色后顯示出細(xì)胞輪廓。

1.4 實(shí)時定量PCR檢測Rb-1和miR-199a-3p的表達(dá)

用Trizol試劑提取心肌標(biāo)本和NMVC總RNA。取1.0 μg總RNA，加入5×的逆轉(zhuǎn)錄試劑4 μL（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒），用oligo（dT）15和random primers逆轉(zhuǎn)錄出cDNA用于檢測編碼基因mRNA水平。取1.0 μg總RNA，用miR-199a-3p特異的RT引物逆轉(zhuǎn)錄出cDNA用于檢測miR-199a-3p水平。分別用GAPDH和U6作為檢測編碼基因和miR-199a-3p表達(dá)水平的內(nèi)參照。在vii A7 Quantitative PCR System（Applied Biosystems，Carlsbad，CA）進(jìn)行PCR反應(yīng)和結(jié)果分析。以2-ΔΔCt法計算Rb-1和miR-199a-3p的相對表達(dá)水平。本文所用PCR引物序列見表1。

1.5 蛋白質(zhì)印記跡法檢測蛋白表達(dá)

收集心肌標(biāo)本和處理后的NMVC，加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解，于4℃10 000×g離心10 min，取上清測濃度，并定量分裝，加入4×上樣緩沖液，99℃加熱10 min使蛋白變性后，置于-80℃保存?zhèn)溆?。蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，經(jīng)電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉常溫封閉1h，根據(jù)蛋白分子質(zhì)量大小位置裁開，分別用相應(yīng)的Ⅰ抗anti-ANP（1∶1 000）、anti-β-MHC（1∶1 000）、anti-α-actin-1（1∶1 000）、anti-Rb-1（1∶1 000）、anti-E2f2（1∶1 000）、anti-GAPDH（1∶5 000）4℃孵育過夜。TBST洗膜后，置于對應(yīng)的II抗（1∶5 000）4℃孵育2 h。ECL發(fā)光試劑盒顯影，應(yīng)用ImageJ軟件進(jìn)行圖像分析。

表1 PCR引物序列Table 1 The sequences of the primers for RT-qPCR

1.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-199a-3p與Rb-1 3'UTR的結(jié)合作用

參照我們已報道方法［18］，分別構(gòu)建包含miR-199a-3p潛在結(jié)合序列的Rb-1 3′UTR重組質(zhì)粒pGL3-Rb-1-627-634及包含結(jié)合序列突變的重組質(zhì)粒pGL3-Rb-1-627-634-MUT。HEK293細(xì)胞（細(xì)胞密度約為1×105個/孔/12孔板）轉(zhuǎn)染200 ng重組質(zhì)粒，50 nmol/L miR-199a-3p mimic以及10 ng pRL-TK（表達(dá)海腎熒光素酶的內(nèi)參照質(zhì)粒）。轉(zhuǎn)染后24 h，測定螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase，F(xiàn)L）及海腎熒光素酶（renilla luciferase，RL）強(qiáng)度，兩種熒光強(qiáng)度比值（FL/RL）變化可反映miR-199a-3p與Rb-1 3′UTR結(jié)合的能力。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較先進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，方差齊性檢驗后采用單因素方差分析（one way ANOVA），并用Bonferroni校正的t檢驗進(jìn)行組間兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微小RNA miR-199a-3p促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大

原代分離乳小鼠心肌細(xì)胞，分別進(jìn)行10 nmol/L Ang-II處理24 h或轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimic。RT-qPCR結(jié)果顯示，10 nmol/L Ang-II處理的NMVC中miR-199a-3p表達(dá)顯著增加且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01；圖1A）；相對對照組 miR-199a-3p在NMVC水平顯著升高（P＜0.001；圖1B），肥大相關(guān)基因Nppa，Acta1，Myh7表達(dá)顯著增加（P＜0.01；圖1C）。同樣的，Western blot結(jié)果顯示，乳小鼠心肌細(xì)胞過表達(dá)miR-199a-3p后，相對對照組，肥大相關(guān)蛋白ANP，α-actin-1，β-MHC表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05；圖1D）。

圖1 過表達(dá)miR-199a-3p促進(jìn)小鼠心肌細(xì)胞肥大Fig.1 Overexpression of miR-199a-3p enhances cardiomyocyte hypertrophy

圖2 MiR-199a-3p在轉(zhuǎn)錄后水平抑制Rb-1的表達(dá)Fig.2 MiR-199a-3p suppresses Rb-1 expression at the post-transcriptional level

2.2 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實(shí)Rb-1與miR-199a-3p具有結(jié)合作用

基于Mirdb數(shù)據(jù)庫（www.mirdb.org）以及TargetScan-Vert（www.targetscan.org）的序列分析提示，Rb-1 3’UTR的627-634堿基可能是miR-199a-3p潛在的結(jié)合位點(diǎn)（圖2A）。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與pGL3-promoter組相對比，重組質(zhì)粒pGL3-Rb-1-627-634與miR-199a-3p mimic共轉(zhuǎn)染組FL/RL值顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而重組質(zhì)粒pGL3-Rb-1-627-634-MUT與miR-199a-3p mimic共轉(zhuǎn)染組FL/RL值無顯著性差異（圖2B）。RT-qPCR結(jié)果顯示，增加乳小鼠心肌細(xì)胞中miR-199a-3p的水平后，相對對照組Rb-1的mRNA水平無明顯差異（圖2C）。Western blot結(jié)果顯示，乳小鼠心肌細(xì)胞過表達(dá)miR-199a-3p后，Rb-1在蛋白水平表達(dá)明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05；圖2D）。這提示miR-199a-3p是在轉(zhuǎn)錄后水平抑制Rb-1的表達(dá)。

2.3 miR-199a-3p靶向Rb-1增加心肌細(xì)胞肥大

鬼筆環(huán)肽染色顯示，乳小鼠心肌細(xì)胞過表達(dá)miR-199a-3p后，心肌細(xì)胞表面積明顯增大；抑制Rb-1的表達(dá)，同樣可以增加心肌細(xì)胞表面積，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01；圖3A）。在乳小鼠心肌細(xì)胞中過表達(dá)miR-199a-3p或者抑制Rb-1的表達(dá)，肥大相關(guān)蛋白ANP，α-actin-1，β-MHC表達(dá)水平明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05；圖3B）。乳小鼠心肌細(xì)胞過表達(dá)miR-199a-3p或者抑制Rb-1的表達(dá)，在細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)E2f2蛋白水平分別顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05；圖3C）；而細(xì)胞核內(nèi)的E2f2蛋白水平分別明顯升高（P＜0.01；圖3D）。這表明miR-199a-3p通過抑制Rb-1的表達(dá)，促進(jìn)了E2f2進(jìn)入細(xì)胞核，從而發(fā)揮調(diào)控心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因表達(dá)的作用。

3 討論

miR-199家族有三個成員，包括miR-199a1、miR-199a2和 miR-199b。miR-199a1和 miR-199a2分別位于19號和1號染色體上，具有相同的成熟序列［19］。miR-199a在壓力超負(fù)荷的肥厚心臟中表達(dá)上調(diào)［20-22］。研究顯示miR-199a抑制HIF-α表達(dá)，增加心肌細(xì)胞肥大［23］。MiR-199a也可以通過激活雷帕霉素（mTOR）復(fù)合物信號傳導(dǎo)的哺乳動物靶點(diǎn)以細(xì)胞自主方式抑制心肌細(xì)胞自噬來促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大；而過表達(dá)Atg5或mTOR處理激活自噬增加了心肌細(xì)胞自噬可減輕由miR-199a過表達(dá)引起的心臟肥大［24］。

圖3 E2f2入核增加介導(dǎo)miR-199a-3p促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大Fig.3 Increase of E2f2 transfer into nucleus mediates cardiomyocyte hypertrophy by miR-199a-3p

本文發(fā)現(xiàn)，在NMVC中過表達(dá)miR-199a-3p可以上調(diào)肥大相關(guān)基因表達(dá)，增加心肌細(xì)胞面積，與以往報道相符［23-24］。已有研究確定cyclin D2/pRb-1通路對于心肌肥大的調(diào)節(jié)有重要作用［25］。壓力負(fù)荷誘發(fā)Rb-1基因敲除小鼠過度的心肌肥厚［26］。我們通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實(shí)了miR-199a-3p可與Rb-1 3’UTR具有結(jié)合作用，并且miR-199a-3p是在轉(zhuǎn)錄后水平抑制Rb-1的表達(dá)。抑制Rb-1表達(dá)能與miR-199a-3p一致性地促進(jìn)心肌細(xì)胞面積增大和心肌細(xì)胞肥大相關(guān)的Anp、α-actin-1、β-MHC的表達(dá)增強(qiáng)。

已有研究表明，E2F2是一種廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，磷酸化的pRb導(dǎo)致E2F2的釋放，從而促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程［16］。E2F2作為Rb-1下游的轉(zhuǎn)錄因子參與對心肌細(xì)胞表型的調(diào)控作用［27-29］。在本文中，在NMVC過表達(dá)miR-199a-3p或者抑制Rb-1表達(dá)，E2f2在細(xì)胞內(nèi)總蛋白水平表達(dá)一致性降低；但細(xì)胞核內(nèi)的E2f2蛋白表達(dá)水平明顯升高。這表明miR-199a-3p通過抑制Rb-1的表達(dá)，促進(jìn)了E2f2進(jìn)入細(xì)胞核，從而發(fā)揮促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因表達(dá)的作用。

綜上，本文通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?、靶基因表達(dá)和相應(yīng)功能性實(shí)驗證實(shí)Rb-1是miR-199a-3p的作用靶基因；miR-199a-3p通過抑制Rb-1的表達(dá)，促進(jìn)了E2f2進(jìn)入細(xì)胞核，從而發(fā)揮促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大作用。在后續(xù)研究中，我們將在整體動物水平，進(jìn)一步明確miR-199a-3p對Rb-1表達(dá)和心肌肥厚的調(diào)控作用。