肖曉慧，李益清,黃克智，謝雙鋒，肖 潔，馬麗萍，尹松梅，聶大年

（廣東省惡性腫瘤表觀遺傳學(xué)和基因調(diào)控重點實驗室//中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東廣州510120）

核輸出蛋白 1（exportin-1，XPO1），又稱為染色體區(qū)域穩(wěn)定蛋白1（chromosome region maintenance 1，CRM1），是一種廣泛存在的核輸出受體蛋白，可識別超過200種蛋白，如關(guān)鍵腫瘤抑制蛋白和調(diào)節(jié)蛋白 p53、p73、p21、p27、IκB、Rb、BRCA1等，這些蛋白被稱為XPO1的貨物蛋白［1］，XPO1可以將其通過核孔從胞核轉(zhuǎn)運到胞漿。XPO1的抑制劑KPT-330口服具有良好的生物利用度，我們和其他研究小組報道了KPT-330對多種血液腫瘤［2-3］和實體瘤［4-5］的作用，當(dāng)前臨床試驗已經(jīng)進入了Ⅱ/Ⅲ期［6-8］。第二代XPO1抑制劑KPT-8602在患者源性異種移植小鼠模型中有更低的中樞神經(jīng)滲透濃度，不會引起厭食、惡心，顯示出更強的生物耐受性和更強的效果［9］。KPT-8602對復(fù)發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌和高危骨髓增生異常綜合征患者的安全性、耐受性和功效研究也進入了臨床試驗的Ⅰ/Ⅱ期（NCT02649790）。非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）是一組具有不同的組織學(xué)特點和起病部位的淋巴瘤，易發(fā)生早期遠處擴散。難治或復(fù)發(fā)的NHL預(yù)后差，缺乏有效的治療方案。一項納入79名各型難治或復(fù)發(fā)的NHL患者的臨床研究結(jié)果表明KPT-330以35 mg/m2的劑量口服是安全的，并且對難治或復(fù)發(fā)的NHL患者具有令人鼓舞和持久的抗癌活性［10］（NCT01607892）。但是 KPT-8602對NHL的研究未見報道。本研究以人組織細胞淋巴瘤細胞系U937細胞為研究對象，探討KPT-8602對淋巴瘤細胞的作用及其可能的機制，以期對NHL的治療提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

人組織細胞淋巴瘤細胞系U937購自中國科學(xué)院細胞庫。細胞接種于用含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，置于含體積分數(shù)5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。人外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）提取于健康自愿獻血者外周靜脈血。KPT-8602粉末（美國Selleck）溶于DMSO中制成濃度為1×107nmol/L的原液，實驗時用完全培養(yǎng)液稀釋成工作液，DMSO的終體積分數(shù)濃度小于0.1%。RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco）；胎牛血清（以色列Biological Industries）；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒（美國Invitrogen）；Cell Counting Kit-8試劑盒（日本Dojindo Laboratories）；BCA蛋白定量試劑盒（北京康為世紀）；核蛋白-胞漿蛋白提取試劑盒（美國 ThermoFisher）；ECL發(fā)光液（美國Millipore）；抗 GAPDH 抗 體（英 國 Abcam，ab181602）；抗 XPO1抗體（美國 Santa Cruz，sc-74454）；抗 Caspase-3抗 體（英 國 Abcam，ab32351）；抗 AKT抗 體（美 國 Cell Signaling Technology，#4691）；抗 p-AKT（Ser473）（美 國Affinity Biosciences，AF0016）；抗 Lamin-B1抗體（美國Immunoway，YT2522）；抗P21 cip1抗體（美國 Cell Signaling Technology，#2947）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（美國Cell Signaling Technology，#7074）；辣根過氧化物酶標記的馬抗小鼠 IgG（美國Cell Signaling Technology，#7076）；DAPI溶液（北京索萊寶）；Alexa Fluor?594標記山羊抗小鼠IgG（H+L）（北京中杉金橋）。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法檢測細胞活力 將細胞按5×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，實驗組加入不同濃度的KPT-8602，對照組加入與實驗組等體積的完全培養(yǎng)液，每組設(shè)3個復(fù)孔；分別培養(yǎng)20、44、68 h 后，在每孔各加入10 μL CCK-8試劑，37℃孵育4 h，測D450nm值。按公式計算細胞的存活率：細胞的存活率=（D實驗孔-D空白孔）/（D對照孔-D空白孔）×100%。

1.2.2 PI單染法檢測細胞周期 將U937細胞按2×105個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，實驗組加入不同濃度的KPT-8602，使其終濃度為10、100、200 nmol/L，對照組加入與實驗組等體積的完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后200×g離心5 min，棄去上清液，PBS洗滌1次，用70%的冰乙醇4℃固定過夜。PBS洗滌1次，棄去上清液，細胞沉淀加50 μL RNA酶，450 μL PI染色液，上機檢測。

1.2.3 AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡將U937細胞按2×105個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，實驗組加入不同濃度的KPT-8602，使其終濃度為100、200、1 000 nmol/L，對照組加入與實驗組等體積的完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后收集細胞，PBS洗滌1次，用試劑盒專用結(jié)合緩沖液重懸細胞，實驗組加入FITC標記的AnnexinV試劑5 μL，室溫避光孵育15 min，然后加入10 μL PI染色混勻，上機檢測。

1.2.4 Western blot 將U937細胞按2×105個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，實驗組加入不同濃度的KPT-8602，使其終濃度為10、100、200、1 000 nmol/L，對照組加入與實驗組等體積的完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后收集細胞，洗滌、裂解細胞，提取細胞總蛋白或胞核蛋白及胞漿蛋白。用BCA法測定蛋白濃度后每孔按30 μg蛋白上樣。將蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%BSA的TBST溶液室溫封閉1 h，加入相應(yīng)的一抗4℃孵育過夜。用TBST洗膜后，加入相應(yīng)的HRP標記的二抗室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光成像。GAPDH作為總蛋白及胞漿蛋白的內(nèi)參蛋白，Lamin B1作為胞核蛋白的內(nèi)參蛋白。

1.2.5 細胞免疫熒光檢測XPO1亞細胞定位 將U937細胞按2×105個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，實驗組加入不同濃度的KPT-8602，使其終濃度為100、200 nmol/L，對照組加入與實驗組等體積的完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后收集細胞，PBS洗滌1次，加入40 g/L多聚甲醛溶液，室溫固定10 min。將細胞懸液涂在防脫載玻片上，60℃烘烤玻片直至干燥，PBS洗3次。0.3%Triton-100溶液破膜15 min，PBS洗3次。避光滴加PBS稀釋的熒光二抗，37℃避光孵育1 h，PBS洗3次。避光滴加DAPI溶液，37℃避光孵育5 min，PBS洗3次，滴加少量防淬滅劑后蓋上干凈蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）描述。兩獨立樣本均數(shù)的比較用t檢驗，多個樣本均數(shù)的比較用單因素或多因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗進行多重比較，統(tǒng)計前經(jīng)方差齊性檢驗，不滿足方差齊性的多個樣本均數(shù)的比較用Kruskal-Willis秩和檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)。檢驗水準定為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 U937細胞XPO1蛋白表達水平高于正常人PBMC

應(yīng)用Western blot法檢測正常人PBMC、U937細胞株XPO1蛋白表達，結(jié)果顯示與正常人PBMC相比，U937細胞的XPO1表達明顯增高（P＜0.001，圖1）。

2.2 KPT-8602抑制U937細胞的活力

用CCK-8法檢測細胞活力，分析不同濃度KPT-8602作用不同時間對細胞活力的影響。結(jié)果顯示：KPT-8602對正常人PBMC的生長基本無明顯的影響，KPT-8602可抑制U937細胞的活力，藥物濃度越大，細胞活力越低（F=41.420，P＜0.001）；隨著作用時間的延長，細胞活力越低（F=17.554，P＜0.001）；時間和藥物濃度兩因素存在交互效應(yīng)（F=1614.574，P＜0.001；圖2）；KPT-8602 作用U937細胞后，24、48、72 h的IC50分別為（280±14）、（123 ± 5）、（84 ± 6）nmol/L。

2.3 KPT-8602使U937細胞周期阻滯在G1期

流式細胞儀檢測顯示，不同濃度KPT-8602處理U937細胞48 h后，各組細胞周期停滯在G1期的比例增加，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=26.232，P＜0.001；圖3），且隨著藥物濃度的增加，G1期所占百分比逐漸增多（r=0.935；P＜0.001）。提示KPT-8602對U937細胞有周期阻滯作用，可使細胞周期阻滯于G1期。

圖1 正常人PBMC、U937細胞XPO1蛋白表達水平Fig.1 The expression of XPO1 in PBMC and U937 cells

圖3 KPT-8602使U937細胞周期阻滯在G1期Fig.3 KPT-8602 blocked the cell cycle of U937 cells at G1 phase

圖2 KPT-8602抑制U937細胞的活力Fig.2 The cell viability inhibition of KPT-8602 on U937 cells

2.4 KPT-8602促進U937細胞凋亡

流式細胞儀檢測顯示，不同濃度KPT-8602作用U937細胞48 h后，細胞凋亡率增加，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.385，P=0.016，圖4），且隨著藥物濃度的增加，凋亡率增加更加明顯（r=0.972；P＜0.001）。表明KPT-8602能促進U937細胞凋亡，且隨著藥物濃度增加，促凋亡作用越明顯。

2.5 KPT-8602抑制U937細胞XPO1蛋白表達

圖4 KPT-8602促進U937細胞凋亡Fig.4 KPT-8602 promotes apoptosis of U937

2.5.1 Western blot 不同濃度KPT-8602作用U937細胞48 h后，XPO1蛋白的表達下降，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.127，P=0.011；圖5），且隨著藥物濃度的增加，XPO1蛋白的表達下降更明顯（r=-0.964，P＜0.001）。表明KPT-8602作為XPO1的抑制劑，可以抑制XPO1在U937細胞的表達。

2.5.2 細胞免疫熒光 圖6為熒光顯微鏡下觀察各組細胞XPO1蛋白的表達情況，可以看到，XPO1在胞漿胞核中均有表達，KPT-8602作用U937細胞48 h后，XPO1在胞漿胞核中的表達均下降。

2.6 KPT-8602促進U937細胞Cleaved Caspase-3蛋白表達

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，KPT-8602可以誘導(dǎo)細胞凋亡，因此我們用Western blot檢測Cleaved Caspase-3蛋白的表達變化，結(jié)果顯示不同濃度KPT-8602作用U937細胞48 h后，Cleaved Caspase-3蛋白的表達增加（r=0.986，P＜0.001），組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.597，P=0.009；圖7）。

2.7 KPT-8602抑制U937細胞p-AKT蛋白表達

Western blot檢測KPT-8602處理U937細胞后p-AKT蛋白的表達，結(jié)果顯示不同濃度KPT-8602作用U937細胞48 h后，AKT的磷酸化水平降低（r=-0.964，P＜0.001），組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.127，P=0.011；圖8）。

圖5 KPT-8602抑制U937細胞XPO1的表達Fig.5 KPT-8602 inhibits the expression of XPO1 in U937 cells

2.8 KPT-8602處理U937細胞后胞核及胞漿蛋白的表達

圖6 熒光顯微鏡觀察U937細胞XPO1的表達情況（400×）Fig.6 XPO1 expression of U937 cells after treatment with KPT-8602 for 48 h by fluorescence microscopy（400×）

圖7 KPT-8602處理U937細胞后Cleaved Caspase-3的表達Fig.7 The expression of Cleaved Caspase-3 in U937 cells after treatment with KPT-8602

圖8 KPT-8602處理U937細胞后p-AKT的表達Fig.8 The expression of p-AKT in U937 cells after treatment with KPT-8602

圖9 KPT-8602處理U937細胞后XPO1、p21蛋白的表達Fig.9 The expression of XPO1 and p21 in U937 cells after treatment with KPT-8602

核漿分離Western blot檢測KPT-8602處理U937細胞后胞核及胞漿XPO1、p21蛋白的變化，結(jié)果顯示不同濃度KPT-8602作用U937細胞48 h后，胞核及胞漿的XPO1蛋白的表達均下降，胞核及胞漿的p21蛋白的表達均升高（圖9）。

3 討論

蛋白質(zhì)的錯誤定位或者異常調(diào)節(jié)將導(dǎo)致各種疾病的產(chǎn)生，包括癌癥、炎癥、自身免疫性疾病等，胞核與胞漿轉(zhuǎn)運系統(tǒng)調(diào)節(jié)腫瘤抑制蛋白的亞細胞定位［11］，XPO1在多種侵襲性腫瘤中都有高表達，并且XPO1在多種惡性腫瘤中的過表達與預(yù)后不良密切相關(guān)［12-15］，因此XPO1有希望成為腫瘤治療的靶點。

XPO1通過依賴Ran-GTP的機制發(fā)揮作用，貨物蛋白結(jié)合XPO1后，在核內(nèi)與Ran-GTP三者形成三聚體，通過核孔復(fù)合物轉(zhuǎn)運至胞漿。在胞漿中，Ran-GTP水解為Ran-GDP，貨物蛋白與XPO1的親和性減弱，從而在胞漿中釋放。XPO1和Ran-GDP再返回核內(nèi)循環(huán)利用［16］。在卵巢腫瘤中，胞漿XPO1增強與更晚的分期，分化差和較高有絲分裂率有關(guān)［17］。在食管腫瘤中，免疫組化也顯示XPO1的定位發(fā)生了改變，從在正常組織中胞核表達轉(zhuǎn)變?yōu)樵诎┙M織中胞核和胞漿表達［18］。XPO1在不同腫瘤中亞細胞定位并不總是一致。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)與正常人PBMC相比，U937細胞的XPO1表達明顯增高，Western blot和免疫熒光的結(jié)果均顯示，KPT-8602作用U937細胞后，XPO1蛋白在胞漿胞核中的表達均下降。

KPT-8602處理U937細胞后，CCK-8結(jié)果顯示KPT-8602抑制U937細胞的活力，72 h的IC50為（83.82±6.021）nmol/L。KPT-8602是新型的核輸出選擇性抑制劑（selective inhibitors of nuclear export，SINE），SINE選擇性抑制XPO1，特異性結(jié)合XPO1的反應(yīng)位點Cys528殘基，使貨物蛋白保留在胞核里［19-20］，從而抑制腫瘤細胞增殖。本實驗還發(fā)現(xiàn)同濃度KPT-8602對正常人PBMC的生長基本無明顯的影響，既往也有研究顯示10 mmol/L KPT-8602對正常人PBMC無明顯影響［21］。

p21是細胞周期蛋白依賴性激酶的重要成員之一，負調(diào)節(jié)細胞周期過程，是腫瘤抑制蛋白。XPO1可以識別和轉(zhuǎn)運富含亮氨酸的核輸出信號（nuclear export signal，NES）的貨物蛋白，包括轉(zhuǎn)錄因子和腫瘤抑制蛋白，如p53、p21、p27、FOXO。有研究表明XPO1抑制劑S109可下調(diào)腎癌細胞Cyclin D1的表達，誘導(dǎo)FOXO1和p21的核積累，從而阻礙細胞周期［22］。與既往研究一致，我們發(fā)現(xiàn)KPT-8602能將細胞周期阻滯在G1期，KPT-8602處理U937細胞后，細胞周期抑制蛋白p21在胞核和胞漿中的表達均升高。說明XPO1抑制劑對腫瘤抑制蛋白的影響可能導(dǎo)致細胞增殖抑制、細胞周期阻滯。

我們發(fā)現(xiàn)KPT-8602作用U937細胞后，細胞凋亡率增加，凋亡蛋白Cleaved Caspase-3蛋白的表達增加，表明KPT-8602通過活化Caspase家族促進細胞凋亡。有研究表明SINE對多種腫瘤細胞具有抑制增殖的作用都與誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)［23］，與本次研究結(jié)果一致。

在本研究中，KPT-8602抑制U937細胞p-AKT的表達，表明可能通過抑制PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制細胞增殖，阻滯細胞周期及促進細胞凋亡。PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細胞生存的重要通路之一，在許多腫瘤中異常激活［24］，針對該途徑的多種小分子抑制劑已被開發(fā)作為癌癥療法［25］。AKT是PI3K/AKT信號通路的關(guān)鍵分子，PI3K的活化使AKT發(fā)生磷酸化而激活，活化的AKT通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)而發(fā)揮作用，活化的AKT能夠調(diào)節(jié)細胞增殖及周期相關(guān)的蛋白p21和p27，進而影響細胞增殖［26］。PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可調(diào)控多個與細胞凋亡有關(guān)的蛋白或家族，如FOXO、Bcl-2家族及Caspase-9和細胞凋亡抑制蛋白等，從而調(diào)控細胞凋亡［27］。

總而言之，新一代XPO1抑制劑KPT-8602可使U937細胞活力下降，使細胞周期阻滯于G1期，誘導(dǎo)細胞凋亡，其機制可能與下調(diào)XPO1表達，抑制PI3K/AKT通路有關(guān)。我們的研究結(jié)果支持了KPT-8602作為NHL患者的新型治療策略具有一定的前景，KPT-8602與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合使用的效果如何，仍需進一步的體外和體內(nèi)實驗或臨床試驗來驗證。