彭紅菊，劉 偉，張建文 ，岳宏程，傅少志

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，四川 瀘州 646000）

宮頸癌（cervical cancer）是女性常見惡性腫瘤，發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率高[1]，2009和2010年位居中國(guó)腫瘤的第10 位[2－3]。阿帕替尼（apatinib）為新一代口服抗血管生成藥物，在胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤中均具有良好的抗腫瘤作用[4－7]，但與放射治療（簡(jiǎn)稱放療）聯(lián)合應(yīng)用的報(bào)道較少。本研究中探討阿帕替尼聯(lián)合放療治療宮頸癌對(duì)Ki－67陽(yáng)性表達(dá)率的抑制作用，以及Ki－67陽(yáng)性表達(dá)率變化與腫瘤生長(zhǎng)抑制率的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、動(dòng)物、儀器與試藥

細(xì)胞、動(dòng)物：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HeLa細(xì)胞株（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院）；健康 BALB／c－nu雌性裸小鼠（4～5周齡、體質(zhì)量18～20 g，重慶騰鑫華阜生物科技公司，動(dòng)物許可證編號(hào)為SCXK＜京＞2014－0004，SPF級(jí)飼養(yǎng)）。

儀器：直線加速器（Elekta）；石蠟切片機(jī)（德國(guó)萊卡儀器有限公司）；新型BGZ系列Ⅱ型高精度烤箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；移液器（德國(guó)艾本德公司）；倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

試藥：甲磺酸阿帕替尼片[江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20140103，規(guī)格按阿帕替尼（C24H23N5O）計(jì)每片 250 mg]，化學(xué)名稱為 N －[4－（1－氰基環(huán)戊基）苯基]－2－（4－吡啶甲基）氨基 －3－吡啶甲酰胺甲磺酸鹽，分子式為C24H23N5O·CH4SO3，相對(duì)分子質(zhì)量為493.58。DMEM高糖完全培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清∶雙抗∶DMEM培養(yǎng)基體積比為10∶1∶90，配制成 10%的完全培養(yǎng)基）；10%胎牛血清（美國(guó) Hyclone公司）；0.25%胰酶（上海碧云天公司）；青霉素－鏈霉素抗體（上海碧云天公司）；Ki－67抗體（美國(guó) BioWorld 公司）；DMSO（美國(guó) Sigma公司）。

1.2 方法

荷瘤小鼠模型建立及分組：取HeLa細(xì)胞株，接種于小鼠右后肢根部皮下，觀察記錄裸鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量、成瘤情況及瘤體積變化。待腫瘤體積達(dá)到 100～150 mm3時(shí)，荷瘤鼠隨機(jī)分為 3組，每組12只。對(duì)照組予生理鹽水0.1 mL／d灌胃第1天至第7天；單純放療組（放療組）連續(xù)觀察 7 d，第 7天開始放療（Dt＝8 Gy／F×1次×1 d）；阿帕替尼聯(lián)合放療組（聯(lián)合組）將配制好的阿帕替尼溶液（質(zhì)量濃度為40 g／L），每只裸鼠按200 mg ／（kg·d）劑量給予灌胃，連續(xù)灌胃 7 d，第 7 天灌胃完成后 2 h 行放療（Dt＝ 8Gy／F×1次 ×1 d）。于實(shí)驗(yàn)完成后第2天各組處死6只，采集腫瘤標(biāo)本，用于Ki－67檢測(cè)，余6只用于觀察腫瘤體積變化。

阿帕替尼溶液配制：取阿帕替尼片（規(guī)格為每片250 mg），按40 mg阿帕替尼 ∶1 mL 0.9%氯化鈉注射液比例配制成質(zhì)量濃度為40 g／L的阿帕替尼灌胃液，于開始灌胃前30 min配制備用。

Ki－67表達(dá)檢測(cè)：采用免疫組化SP法檢測(cè)，細(xì)胞胞核染色呈棕黃色或褐色判為陽(yáng)性。隨機(jī)選取各組腫瘤組織切片中高倍鏡下5個(gè)視野，并計(jì)數(shù)Ki－67陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算5個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例即為Ki－67陽(yáng)性表達(dá)率。

腫瘤體積和腫瘤生長(zhǎng)抑制率計(jì)算：各組于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第1天開始，每隔2 d測(cè)量各組移植瘤最大直徑（A，mm）與最小直徑（B，mm），直至第 25天。計(jì)算各組腫瘤體積（TV）平均值，作為各組最終用于評(píng)價(jià)TV，根據(jù)最終TV 計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率（TGIR），TV＝ A×B／2；TGIR＝（TV對(duì)照組－單純放療組 ／TV聯(lián)合組）／TV對(duì)照組×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ki－67 陽(yáng)性表達(dá)率

聯(lián)合組Ki－67陽(yáng)性表達(dá)率低于15%，放療組高于60%，分別比對(duì)照組降低 84.49%和 28.06%；聯(lián)合組Ki－67陽(yáng)性表達(dá)率比放療組降低78.44%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。詳見表 1和圖 1。

表1 各組 Ki－67表達(dá)情況比較（±s，n＝6）

表1 各組 Ki－67表達(dá)情況比較（±s，n＝6）

注: 為與對(duì)照組比較， 為與放療組比較。下表同。

P1值 ／t1值P2值 ／t2值組別對(duì)照組放療組聯(lián)合組陽(yáng)性表達(dá)率（±s，%）92.83 ± 4.04 66.78 ± 5.01 14.40 ± 2.72 0.00 ／7.01 0.00 ／16.810.00 ／15.91

圖1 腫瘤Ki－67表達(dá)情況（×400）

2.2 腫瘤體積和TGIR

聯(lián)合組腫瘤體積最小，對(duì)照組最大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。聯(lián)合組和放療組腫瘤體積分別比對(duì)照組縮小52.55%和32.64%，聯(lián)合組比放療組縮小29.56%。聯(lián)合組TGIR最高，比放療組高22.17%。詳見表2。

3 討論

Ki－67是反映腫瘤細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)，在腦膜瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌等多種腫瘤中均有不同程度表達(dá)[8－12]。世界衛(wèi)生組織（WHO）Ⅱ級(jí)腦膜瘤中，Ki－67的平均表達(dá)值為 13% （1% ～47% ）[8]。結(jié)直腸癌中，Ki－67表達(dá)陽(yáng)性表達(dá)率≥20%[9]。組織學(xué)檢測(cè)宮頸上皮內(nèi)瘤變1，2，3級(jí)Ki－67陽(yáng)性表達(dá)率分別為2.13% ，19.93% 和 23.22% ，宮頸癌中 Ki－ 67 陽(yáng)性表達(dá)率為 69.72% ～ 75.0%[12－13]。提示宮頸癌是具有高度增殖活性的腫瘤。本研究中，宮頸癌HeLa細(xì)胞Ki－67陽(yáng)性表達(dá)率為（92.83 ±4.04）% ，高于文獻(xiàn)[12 －13]報(bào)道，預(yù)示宮頸癌HeLa細(xì)胞是具有高增殖活性。

腫瘤組織中Ki－67陽(yáng)性表達(dá)率高低與預(yù)后有相關(guān)性。WHOⅡ級(jí)腦膜瘤術(shù)后放療與Ki－67表達(dá)研究顯示，局部復(fù)發(fā)患者Ki－67平均表達(dá)值為15%，無(wú)復(fù)發(fā)患者 Ki－67平均表達(dá)值為12%，Ki－67＞13%顯著影響局部控制率[8]。三陰乳腺癌新輔助化療，病理完全緩解和無(wú)效的Ki－67表達(dá)顯著截止值為20%[14]。結(jié)直腸癌中Ki－67表達(dá)與TNM分期密切相關(guān)，TNM分期越高，Ki－67表達(dá)越高，Ki－67高表達(dá)的5年無(wú)復(fù)發(fā)生存率為 53%，Ki－67低表達(dá)為 89%[9]。宮頸癌 Ki－67陽(yáng)性表達(dá)中位總生存期55個(gè)月，陰性表達(dá)60個(gè)月，局部控制率分別為 80.7%和 89.2%[15]。因此，宮頸癌 Ki－67陽(yáng)性表達(dá)對(duì)生存期和局部控制率均有影響。

降低腫瘤組織中Ki－67表達(dá)水平，有可能改善患者預(yù)后。宮頸癌研究中，卡鉑＋紫杉醇聯(lián)合化療，可使Ki－67陽(yáng)性表達(dá)率由化療前的76.00%降至化療后的20.00%[16]。本研究結(jié)果提示，宮頸癌單純放療對(duì)Ki－67陽(yáng)性表達(dá)率抑制非常有限，在放療基礎(chǔ)上聯(lián)合阿帕替尼可明顯抑制Ki－67陽(yáng)性表達(dá)率，預(yù)示阿帕替尼聯(lián)合放療能明顯抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖活性。

腫瘤體積越大，負(fù)荷越大，腫瘤生長(zhǎng)越快，腫瘤生長(zhǎng)抑制率越低，無(wú)論是化療、手術(shù)治療，還是放療，首要結(jié)果是降低腫瘤負(fù)荷，提高腫瘤生長(zhǎng)抑制率。因此，腫瘤生長(zhǎng)抑制情況與抗腫瘤治療相關(guān)[17]，紫杉醇、他莫昔芬等與腫瘤生長(zhǎng)抑制研究較多相關(guān)[18－19]。本研究結(jié)果提示，阿帕替尼聯(lián)合放療能使宮頸癌HeLa細(xì)胞腫瘤體積明顯縮小，效應(yīng)遠(yuǎn)大于單純放療，腫瘤生長(zhǎng)抑制率提高。宮頸癌阿帕替尼聯(lián)合放療可能存在明顯協(xié)同作用。

綜上所述，宮頸癌阿帕替尼聯(lián)合放療可明顯抑制Ki－67陽(yáng)性表達(dá)率，抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖活性，導(dǎo)致腫瘤體積縮小，提高腫瘤生長(zhǎng)抑制，可能存在明顯協(xié)同抗腫瘤作用，Ki－67陽(yáng)性表達(dá)率降低是可能機(jī)制。建議Ki－67陽(yáng)性表達(dá)率較高的宮頸癌患者臨床使用。