于敬坤，李明志，隨振陽，張 琪，田 煒，胡 琨,楊光華,張國志,王長友*

(1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科,河北 唐山 063000; 2.華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗研究中心,河北 唐山 063000)

結(jié)腸癌是最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，在我國，其發(fā)病率及死亡率均高于世界水平，無數(shù)患者飽受結(jié)腸癌病痛的折磨[1]。目前，我國治療結(jié)腸癌的主要方式包括外科手術(shù)切除及以其為基礎(chǔ)的綜合治療、化學(xué)藥物治療、放射治療、新輔助放化療等；但我國結(jié)直腸癌患者術(shù)后5年生存期依然徘徊在60%左右。二甲雙胍(metformin)是臨床上常用的降糖藥物，但有相關(guān)病例對照研究資料表明，二甲雙胍的使用與惡性腫瘤發(fā)生風(fēng)險的下降具有一定相關(guān)性，二甲雙胍使用時間的延長及使用次數(shù)的增加，可使惡性腫瘤的發(fā)病風(fēng)險降低[2-3]。凋亡是細(xì)胞生長增殖過程中重要的調(diào)節(jié)方式，在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展及死亡過程中發(fā)揮著重要作用。該實驗研究二甲雙胍聯(lián)合順鉑對HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞的影響，并探究其機(jī)制，為二甲雙胍優(yōu)化化療方案提供實驗依據(jù)及理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞獲贈于華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗研究中心分子診斷實驗室。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM完全培養(yǎng)基(賽默飛世爾[蘇州]儀器有限公司)；四季青胎牛血清(浙江天杭生物公司)；青鏈霉素混合液、胰蛋白酶(美國Gibco)；鹽酸二甲雙胍(北京索萊寶科技有限公司)；順鉑注射液(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)；MTT試劑盒、caspase-3(激活型)抗體、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠/兔IgG(H+L)(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；96孔板、6孔板(德國Eppendorfna)；顯微鏡(日本Nikon Eclipse TS100)；酶標(biāo)儀、顯影儀、電泳轉(zhuǎn)膜相關(guān)器材(上海Bio-Rad公司)；Bcl-2、Bax、Akt、p-Akt、Gsk-3、p-Gsk-3 抗體(Cell Signaling)；GAPDH抗體(天徳悅[北京]生物科技有限責(zé)任公司)；流式細(xì)胞儀及FITC偶聯(lián)Annexin V凋亡檢測試劑盒I(美國BD公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液、約90% DMEM完全培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞，并置于37℃恒溫、95%O2、5%CO2空氣孵箱中(相對濕度為95%)。細(xì)胞生長密度達(dá)80%以上時，可1∶2或1∶3傳代(傳代時間約為2～3 d)，HCT-8細(xì)胞呈單層貼壁生長，待形成致密單層細(xì)胞時，可利用胰酶消化，取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3.2 MTT實驗檢測細(xì)胞增殖能力

將HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞均勻地播種在96孔板中(每孔約104個細(xì)胞)，待細(xì)胞完全貼壁后，分別用含有不同濃度鹽酸二甲雙胍(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mg/mL)、不同濃度順鉑(0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 μg/mL)的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；培養(yǎng) 24、48、72 h后移除細(xì)胞培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗兩次。每孔加入了100 μL的的單純細(xì)胞培養(yǎng)液及10 μL濃度為5 mg/mL的MTT試劑；將96孔板置于恒溫箱內(nèi)孵化，待紫藍(lán)色結(jié)晶完全形成后移除細(xì)胞培養(yǎng)液，然后加入100 μL的二甲基亞砜溶液(DMSO)，輕輕晃動使結(jié)晶完全溶解，并用酶標(biāo)儀測定各孔在490 nm波長下的吸光值。注意設(shè)置空白對照組。

根據(jù)MTT劑量依賴性實驗結(jié)果，1.50 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20 μg/mL順鉑對HCT-8細(xì)胞具有抑制作用，且在有效抑制范圍內(nèi)，便于調(diào)控，因此可采用1.50 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20 μg/mL順鉑作為后續(xù)實驗的藥物濃度，設(shè)置二甲雙胍組(MET)、順鉑組(DDP)、二甲雙胍聯(lián)合順鉑組(MET+DDP)、空白對照組(CK)4組，繼續(xù)行MTT實驗，觀察HCT-8細(xì)胞24、48、72 h的增殖能力，并判斷兩種藥物的協(xié)同作用。

藥物協(xié)同作用效能用協(xié)同指數(shù)(combined index,CI)來表示，采用金正均法(概率相加法)計算：

EA+B=EA+EB-EA×EB

其中EA代表A藥單獨作用時的效應(yīng)；EB是B藥單獨作用時的效應(yīng)；EA+B是A藥與B藥聯(lián)合作用時的效應(yīng)，為聯(lián)合用藥效應(yīng)的期望值。

虛擬仿真實驗技術(shù)是指以計算機(jī)網(wǎng)絡(luò)為核心，利用多媒體技術(shù)虛擬實驗環(huán)境進(jìn)行人機(jī)交互和仿真，學(xué)生利用虛擬實驗教學(xué)平臺，可在模擬的真實環(huán)境中完成實驗項目，該實驗技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)藥院校逐步應(yīng)用[4-5]。2013年8月教育部發(fā)布教高司函〔2013〕94號文件，在全國開展“國家級虛擬仿真實驗教學(xué)中心”的認(rèn)定工作，文件提出將現(xiàn)代信息技術(shù)整合至教學(xué)應(yīng)用中，從國家層面確認(rèn)了對網(wǎng)絡(luò)化虛擬學(xué)習(xí)的認(rèn)可[6]。虛擬實驗教學(xué)已經(jīng)迅速發(fā)展成為現(xiàn)代實驗教學(xué)的重要方式之一，這種教學(xué)模式可以培養(yǎng)學(xué)生的實踐能力和創(chuàng)新能力，提高應(yīng)用型人才培養(yǎng)的質(zhì)量。

Q=EA+B÷(EA+EB-EA×EB)

Q值的意義：0.85-1.15為效應(yīng)單純相加；1.15-20為效應(yīng)增強(qiáng)；>20為效應(yīng)顯著增強(qiáng)；0.85-0.55為效應(yīng)拮抗；<0.55為相應(yīng)明顯拮抗(協(xié)同作用：兩種以上藥物聯(lián)合應(yīng)用時，如各藥物的作用方向一致為協(xié)同作用；反之成為拮抗作用；當(dāng)Q值≥0.85時，即兩種藥物具有協(xié)同作用)。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡比例

將HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞均勻地播種在6孔板中并培養(yǎng)，密度達(dá)70%～80%時分別給予含1.5 mg/mL鹽酸二甲雙胍(MET組)、20 μg/mL順鉑(DDP組)、1.5 mg/mL鹽酸二甲雙胍及20 μg/mL順鉑(MET+DDP組)、不含藥物(CK組)的細(xì)胞培養(yǎng)液2 mL繼續(xù)培養(yǎng)， 48 h后移除細(xì)胞培養(yǎng)液，各組均收集約106個細(xì)胞于5 mL試管內(nèi)；試管內(nèi)加入400 μL的1X Binding Buffer及5 μL FITC Annexin V，室溫孵化15 min后加入5 μL PI，在流式細(xì)胞儀中檢測各組細(xì)胞的凋亡比例，并計算聯(lián)合用藥的協(xié)同指數(shù)。

1.3.4 Western blotting觀察HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞Bcl-2、Bax、caspase-3(激活型)以及AKT/GSK-3 通路蛋白的表達(dá)水平

將HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞同上分組并培養(yǎng)，48 h后用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，每孔內(nèi)加入100 μL含有1%PMSF的組織細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min后刮下細(xì)胞并在預(yù)冷的低溫高速離心機(jī)中離心15 min(14000 r/min)，收集上清液。BCA法測定蛋白濃度并變性，依次制備8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜(PVDF膜)上，室溫下封閉液(5% 脫脂奶粉、0.02 mmol/L Tris-HCL、0.5 mmol/L NaCl、0.1% 吐溫20、pH 7.5)封閉2 h，TBST(0.02 mmol/L Tris-HCL、0.5 mmol/L NaCl、0.1% 吐溫20、pH 7.5)洗膜3次后，4℃敷一抗過夜，TBST洗膜3次后加入二抗孵化2 h，TBST洗凈二抗，加入顯影劑在顯影儀內(nèi)顯影，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，在內(nèi)參平齊的前提下，觀察各組細(xì)胞中各蛋白的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測細(xì)胞增殖能力

2.1.1 鹽酸二甲雙胍及順鉑對HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力、相對增殖能力的影響

在不同濃度鹽酸二甲雙胍作用下，24 h時HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞在鹽酸二甲雙胍濃度下約0～2.00 mg/mL范圍內(nèi)，出現(xiàn)細(xì)胞增殖強(qiáng)于無藥物干預(yù)(可能由于藥物誘發(fā)細(xì)胞應(yīng)激性增殖)，藥物濃度高于2 mg/mL時，HCT-8細(xì)胞增殖能力隨藥物濃度升高而逐漸遞減；48、72 h時，在鹽酸二甲雙胍濃度為0～4.50 mg/mL范圍內(nèi)，HCT-8細(xì)胞的增殖能力總體上與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，隨著鹽酸二甲雙胍藥物濃度的增高，細(xì)胞增殖能力隨之遞減(圖1)。在不同濃度順鉑作用下，24 h時HCT-8細(xì)胞的增殖能力與順鉑藥物濃度呈負(fù)相關(guān)；48、72 h時HCT-8細(xì)胞增殖能力均在一定濃度范圍內(nèi)隨順鉑濃度增高而降低，48 h順鉑濃度約高于30 μg/mL、72 h順鉑濃度約高于15 μg/mL時，HCT-8細(xì)胞增殖能力不隨順鉑濃度增高而發(fā)生明顯改變(圖2)。在鹽酸二甲雙胍及順鉑作用下，HCT-8細(xì)胞的相對增殖能力隨著作用時間的延長(相對增殖能力=某一時間內(nèi)實驗組的細(xì)胞增殖能力/同時刻對照組的細(xì)胞增殖能力×100%；相對增殖能力可反映細(xì)胞增殖受抑制程度)，總體上表現(xiàn)為遞減趨勢(圖1、圖2)。

圖1 鹽酸二甲雙胍對HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力及相對增殖能力的影響Figure 1 The effect of metformin hydrochloride on proliferation and relative proliferation ability of human colon cancer HCT-8 cells

圖2 順鉑對HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力及相對增殖能力的影響Figure 2 The effect of cisplatin on proliferation and relative proliferation ability of human colon cancer HCT-8 cells

MTT檢測HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞在1.50 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20 μg/mL順鉑及聯(lián)合作用24、48、72 h時的細(xì)胞增殖能力；如表1，鹽酸二甲雙胍組(MET)、順鉑組(DDP)及聯(lián)合用藥組(MET+DDP)的細(xì)胞增殖能力要弱于空白對照組(CK)，聯(lián)合用藥組(MET+DDP)的細(xì)胞增殖能力明顯低于其它3組(P<0.05)。藥物協(xié)同指數(shù)(CI)Q值在藥物作用24、48、72 h時均大于0.85，提示MET+DDP的聯(lián)合抗HCT-8細(xì)胞增殖能力的作用強(qiáng)于MET組、 DDP組。

1.5 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20 μg/mL順鉑及聯(lián)合用藥作用于HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞48 h時(圖3)，對照組的HCT-8細(xì)胞體積較小，排布密集，形態(tài)較為規(guī)整，可見分裂核；順鉑組較對照組細(xì)胞體積增大明顯，多核細(xì)胞比例增多；二甲雙胍組較對照組，細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)空泡化明顯；聯(lián)合用藥組細(xì)胞既體積增大明顯，胞質(zhì)又出現(xiàn)空泡化。

2.2 1.5 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20 μg/mL順鉑及聯(lián)合用藥對HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

DDP組、MET組、MET+DDP組、CK組四組的總凋亡比例分別是(19.7267±0.2043)%、(16.2567±1.3258)%、(33.7567±0.7182)%、(10.3667±0.1301)%；本實驗中，當(dāng)1.5 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20 μg/mL順鉑及聯(lián)合用藥作用于HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞48 h時(圖4)，均可引起HCT-8細(xì)胞的總凋亡比例上升(對比CK組，并具有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.05)；MET+DDP組HCT-8細(xì)胞的總凋亡比例最高，且均強(qiáng)于MET組、DDP組及CK組，P<0.05。MRT+DDP組促HCT-8細(xì)胞凋亡的協(xié)同指數(shù)為1.0299>0.85，提示1.5 mg/mL鹽酸二甲雙胍與20 μg/mL順鉑對促進(jìn)HCT-8細(xì)胞具有協(xié)同作用。

2.3 Western blotting 檢測藥物作用48 h時相關(guān)蛋白的表達(dá)活性

2.3.1 1.5 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20μg/mL順鉑及聯(lián)合用藥影響HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)

Bcl-2的活性在CK、MET、DDP、MET+DDP 4組內(nèi)依次為(1.0383±0.1496)、(0.8422±0.1228)、(0.6507±0.1493)、(0.4629±0.1315)，4組間彼此存在統(tǒng)計學(xué)差異，且呈遞減趨勢，P<0.05；而Bax的活性在CK、MET、DDP、MET+DDP 4組內(nèi)依次為(0.5714±0.1226)、(0.7379±0.1108)、(0.9001±0.1008)、(1.1355±0.1302)，4組間也彼此存在統(tǒng)計學(xué)差異，且呈遞增趨勢，P<0.05；Bax/Bcl-2值在CK、MET、DDP、MET+DDP 4組內(nèi)分別是(0.6398±0.1988)、(0.8887±0.1505)、(1.2557±0.1943)、(1.9982±0.3168)，依次遞增，并具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05(圖5)。

2.3.2 1.5 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20μg/mL順鉑及聯(lián)合用藥影響HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3(激活型)的表達(dá)藥物作用48 h時，caspase-3(激活型)的表達(dá)在CK、MET、DDP、MET+DDP 4組內(nèi)分別是(0.5701±0.0535)、(0.7288±0.0855)、(0.8302±0.0506)、(0.9347±0.0902)，且caspase-3(激活型)的表達(dá)呈依次遞增的趨勢，并具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05(圖6)，提示在MET+DDP組HCT-8細(xì)胞中無凋亡促進(jìn)活性的p-caspase-3進(jìn)行蛋白剪切形成具有促凋亡活性的caspase-3(激活型)的比例增高。

表1 鹽酸二甲雙胍聯(lián)合順鉑對HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響(OD值)Table 1 The effect of metformin hydrochloride combined with cisplatin on the proliferation capacity of human colon cancer HCT-8 cells (OD value)

注：與DDP組相比，*P<0.05；與MET組相比，#P<0.05；與MET+DDP組相比，※P<0.05；與CK組相比，&P<0.05。

Note: Compared with the DDP group,*P< 0.05.Compared with the MET group,#P< 0.05.Compared with the MET+DDP group,※P< 0.05. Compared with the CK group,&P< 0.05.

注：DDP、MET、MET+DDP、CK四組給予相應(yīng)處理48 h后各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。圖3 DDP、MET、MET+DDP、CK 各組HCT-8細(xì)胞于培養(yǎng)48 h的細(xì)胞觀察(×200)Note. The morphological changes of HCT-8 cell in the DDP, MET, MET+DDP and CK groups were given corresponding treatment for 48 h.Figure 3 Observation of the HCT-8 cells in DDP, MET, MET+DDP and CK groups after 48 h

注：DDP、MET、MET+DDP、CK四組相比較，*P<0.05。圖4 鹽酸二甲雙胍聯(lián)合順鉑作用于HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞48 h時對其凋亡的影響Note. Compared with the four groups of DDP, MET, MET+DDP and CK, *P< 0.05.Figure 4 Effect of metformin hydrochloride combined with cisplatin on apoptosis in the HCT-8 human colon cancer cells at 48 h after treatment.

2.3.3 1.5 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20 μg/mL順鉑及聯(lián)合用藥影響HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞AKT/GSK-3β通路蛋白的表達(dá)

AKT/GSK-3β通路蛋白在CK、MET、DDP、MET+DDP 各組內(nèi)的活性如圖7所示，AKT、GSK-3β在4組內(nèi)表達(dá)活性無明顯差異，P>0.05；p-AKT、p-GSK-3β在CK、MET、DDP、MET+DDP 4組內(nèi)分別表達(dá)為(1.0928±0.1182)、(0.8350±0.0579)、(0.7247±0.0500)、(0.6021±0.0447)及(1.0167±0.0669)、(0.8467±0.1017)、(0.6899±0.0680)、(0.5551±0.0710)，且均表現(xiàn)為依次遞減趨勢，并具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

注： DDP、MET、MET+DDP及CK四組相比較，* P<0.05，# P<0.05，&P<0.05。圖5 DDP、MET、MET+DDP、CK各組HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)活性Note. Compared with the four groups of DDP, MET, MET+DDP and CK, * P < 0.05,# P<0.05,& P<0.05.Figure 5 Expression of Bcl-2 and Bax of HCT-8 human colon cancer cells in the DDP, MET, MET+DDP and CK groups

注： DDP、MET、MET+DDP及CK四組相比較，* P<0.05。圖6 DDP、MET、MET+DDP、CK各組HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3(激活型)的表達(dá)活性Note. Compared with the four groups of DDP, MET, MET+DDP and CK, *P < 0.05.Figure 6 Expression of caspase-3 (activated) in the human colon cancer HCT- 8 cells of the DDP, MET, MET+DDP and CK groups

注： DDP、MET、MET+DDP及CK四組相比較，*P<0.05，# P<0.05。圖7 DDP、MET、MET+DDP、CK各組HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞AKT/GSK-3β通路蛋白的表達(dá)活性Note. Compared with the four groups of DDP, MET, MET+DDP and CK, * P<0.05,# P<0.05.Figure 7 Protein expression of AKT/GSK-3β signaling pathways in the human colon cancer HCT-8 cells in the DDP, MET, MET+DDP and CK groups

3 討論

結(jié)腸癌是我國第6大高發(fā)惡性腫瘤，在癌癥死亡患者中排第5位[4]；主要是由長期不合理飲食、腸道慢性病惡變、遺傳等因素引起，近年來逐漸趨于青少年發(fā)展[5-6]，相關(guān)研究指出肥胖患者及糖尿病患者結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險會高于正常人[7-9]。鉑類藥物(platinum drugs)是治療結(jié)腸癌的重要化療藥物，具有較高的抗腫瘤效能，諸多基礎(chǔ)實驗及臨床研究已證明單用或聯(lián)合應(yīng)用鉑類藥物均有明顯的抗腫瘤作用[10-13]。順鉑(cisplatin、DDP)是第一代鉑類藥物，屬于細(xì)胞周期非特異性藥物，可通過抑制細(xì)胞核分裂使癌細(xì)胞生長周期受抑制[14]，但胞質(zhì)受影響較小，因此可出現(xiàn)胞體增大現(xiàn)象。實驗中順鉑可明顯降低HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力，并存在劑量及時間依賴性。但順鉑也有明顯的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐等消化道反應(yīng)及腎毒性、神經(jīng)毒性、骨髓抑制、過敏反應(yīng)、心肺功能異常等，減少順鉑用藥可減少不良反應(yīng)的發(fā)生或減輕不良反應(yīng)的程度[15]；另外，隨著順鉑等鉑類藥物的使用，腫瘤細(xì)胞耐藥性也會逐漸增強(qiáng)[16]。因此聯(lián)合用藥、減少順鉑的使用成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的重點之一。二甲雙胍是臨床上的一線降糖藥物。隨著對其研究的不斷深入，部分學(xué)者提出二甲雙胍具有降低腫瘤發(fā)生風(fēng)險的作用[17-19]；有實驗表明二甲雙胍可能通過促進(jìn)胞內(nèi)脂類物質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌水平、抑制血小板亢進(jìn)及降低血液高凝狀態(tài)等途徑，抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展[20]；在一定藥物范圍內(nèi)，隨著鹽酸二甲雙胍濃度的增高及作用時間的增加，HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力也隨之降低，表明二甲雙胍可抑制HCT-8細(xì)胞的生長、增殖，并存在劑量、時間依賴性(圖1)。且二甲雙胍與順鉑具有一定的協(xié)同效果，二者聯(lián)合用藥時，HCT-8細(xì)胞的增殖能力均明顯弱于單藥使用，提示二甲雙胍可減少化療藥物的使用劑量，優(yōu)化化療方案。

凋亡是細(xì)胞生長增殖過程中重要的調(diào)節(jié)方式，可主動清除衰老、破損、具有異常功能及潛在危險的細(xì)胞，如有癌變危險且自身又無法修復(fù)逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞等[21]。胞質(zhì)空泡化是細(xì)胞凋亡的重要表現(xiàn)形式，二甲雙胍可使HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)空泡化，可見二甲雙胍具有促進(jìn)HCT-8細(xì)胞凋亡的潛能[22]。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果(圖4)提示，1.50 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20 μg/mL順鉑及聯(lián)合用藥可增強(qiáng)HCT-8細(xì)胞的凋亡，并且聯(lián)合用藥引起HCT-8細(xì)胞的凋亡比例明顯高于單藥使用。細(xì)胞凋亡的調(diào)控信號通路主要分為外在信號通路(細(xì)胞表面死亡受體途徑)及內(nèi)在信號通路(線粒體凋亡通路)[22-23]。Bcl-2家族蛋白是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，主要調(diào)控內(nèi)在凋亡途徑，作用靶點是線粒體[24]。Bcl-2是Bcl-2家族中典型的抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白，二者協(xié)同發(fā)揮作用，通過改變線粒體外膜的通透性、改變線粒體形態(tài)、影響膜間隙蛋白釋放及caspase級聯(lián)活化等途徑影響細(xì)胞凋亡過程[25]。HCT-8細(xì)胞在二甲雙胍、順鉑作用下，促凋亡蛋白Bax活性明顯增高，抑凋亡蛋白Bcl-2活性降低，Bax/Bcl-2值明顯增高，表明二甲雙胍及順鉑均可通過調(diào)控線粒體凋亡途徑促進(jìn)HCT-8細(xì)胞的凋亡，且二者聯(lián)合作用時，Bax/Bcl-2值較單藥作用結(jié)果均明顯增高，說明聯(lián)合用藥可能調(diào)控線粒體凋亡途徑作用更強(qiáng)。

天冬氨酸特異性蛋白酶(caspases)是另一組與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白酶家族，在細(xì)胞凋亡最終途徑的調(diào)控中具有關(guān)鍵作用[26]。caspase-3(激活型)是重要的凋亡效應(yīng)因子，是凋亡的執(zhí)行蛋白、凋亡關(guān)鍵的蛋白酶[27]；正常細(xì)胞中的caspase-3是以無活性的p-caspase-3存在的，在一定條件下，p-caspase-3可通過蛋白剪切形成具有活性的caspase-3(激活型)，從而誘發(fā)級聯(lián)放大效應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在MET、DDP、MET+DDP組中，HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞的caspase-3(激活型)活性均高于CK組，且MET+DDP組的caspase-3(激活型)活性也高于其他各組，再次說明二甲雙胍與順鉑具有協(xié)同促HCT-8細(xì)胞凋亡作用。 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)是細(xì)胞內(nèi)重要的通路蛋白，可廣泛參與細(xì)胞的生理病理過程，其活性表達(dá)形式p-AKT(磷酸化AKT)可以通過促進(jìn)絲氨酸/蘇氨酸殘基底物磷酸化從而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡作用[28-29]；糖原合成激酶-3β(GSK-3β)是AKT的直接作用底物之一，p-AKT可以與GSK-3β直接結(jié)合，改變其Ser9位點結(jié)構(gòu)，使GSK-3β發(fā)生磷酸化修飾，從而抑制GSK-3β活性[30]。鹽酸二甲雙胍、順鉑分別作用于HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)AKT、GSK-3β活性相對恒定不變，p-AKT、p-GSK-3β活性明顯降低，說明二甲雙胍及順鉑均可能通過抑制AKT/GSK-3β信號通路實現(xiàn)促凋亡作用；當(dāng)鹽酸二甲雙胍聯(lián)合順鉑作用于HCT-8細(xì)胞時，p-AKT、p-GSK-3β的活性較單藥作用減弱，表明聯(lián)合用藥可協(xié)同加強(qiáng)對AKT/GSK-3β信號通路的抑制作用。

綜上，二甲雙胍、順鉑可能通過調(diào)控AKT/GSK-3β/Bcl-2家族蛋白通路促進(jìn)HCT-8人類結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡，并促進(jìn)p-caspase-3轉(zhuǎn)化為caspase-3(激活型)；二甲雙胍與順鉑對HCT-8細(xì)胞凋亡具有協(xié)同作用，聯(lián)合用藥促凋亡作用強(qiáng)于單藥作用。