解一舟，李玉珍，朱 慧，李宏強(qiáng)

(北京建生藥業(yè)有限公司，北京 100039)

近幾十年來(lái)，隨著人類平均壽命的增加及生活習(xí)慣、生活環(huán)境改變等因素，人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患病率正在逐年升高[1]，根據(jù)國(guó)內(nèi)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，我國(guó)顱內(nèi)腫瘤的患病率為32/10萬(wàn)人，平均年發(fā)病率為66/10萬(wàn)人，并呈逐年上升的趨勢(shì)[2-3]。從理論上講，藥物要首先應(yīng)能通過(guò)血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)中達(dá)到一定的血藥濃度，才能發(fā)揮一定的作用。在Kastin證明促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone, ACTH)等肽類物質(zhì)可完整穿越BBB之前，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為肽類物質(zhì)不能穿越BBB，隨著BBB研究的不斷深入，越來(lái)越多的可跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)的肽類物質(zhì)被報(bào)道[4]。一些具有脂溶性、一定分子量及特定電荷的小分子物質(zhì)能夠直接從血液擴(kuò)散穿越BBB進(jìn)入CNS，極大部分的大分子物質(zhì)，如重組蛋白等均難以通過(guò)擴(kuò)散的途徑穿越BBB[5]。目前已知的跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制主要包括以下幾種：(1)水溶性小分子及其他生命活動(dòng)所必需的的營(yíng)養(yǎng)類物質(zhì)，如氨基酸、葡萄糖等，通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管腔面與基底側(cè)上的轉(zhuǎn)運(yùn)受體穿越BBB；(2)多肽或蛋白類物質(zhì)可以通過(guò)吸附介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)、受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)或載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)等途徑實(shí)現(xiàn)跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)；(3)小分子量脂溶性物質(zhì)可經(jīng)被動(dòng)擴(kuò)散途徑跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腦內(nèi)[4]。盡管經(jīng)過(guò)了數(shù)十年的研究，如何使藥物高效地穿越BBB依然是治療CNS疾病的藥物研發(fā)的難點(diǎn)。由于BBB結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，通常需要建立體外模型來(lái)開展諸如藥物跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)等研究，文中也會(huì)介紹主流的模型及裝置，如Transwell裝置、NV生物反應(yīng)器等，同時(shí)也比較了它們的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用，便于根據(jù)不同研究目的選擇合適的模型或裝置。

肽(peptide)是α-氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物，通常指的是100個(gè)氨基酸以下的大分子物質(zhì)，多肽通常也是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物。在哺乳動(dòng)物體中，肽類物質(zhì)主要由外周臟器或CNS產(chǎn)生，如胰島素(insulin)、胰高血糖素(glucagon)可調(diào)節(jié)血糖濃度，神經(jīng)肽作為CNS的遞質(zhì)在大腦的不同部位發(fā)揮著不同的生理作用，如痛覺、睡眠、情緒、學(xué)習(xí)、攝食、痛覺等均有調(diào)節(jié)作用，另外，神經(jīng)系統(tǒng)本身的分化和發(fā)育也受神經(jīng)肽的調(diào)節(jié)。

1 已發(fā)現(xiàn)的可通過(guò)BBB的多肽或蛋白類物質(zhì)

1.1 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophin, NT)對(duì)CNS的創(chuàng)傷性、退化性和缺血性疾病均具有治療潛力，如NGF、NT-3、NT-4/5及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)均可被選擇性地輸送至腦內(nèi)[5]，而另外某些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子卻不能跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)，如人類膠質(zhì)細(xì)胞衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(human glia-derived neurotrophic factors)等[6]。

1.2 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肽

上表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)[7]神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)、的胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor, IGF)[8]等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)多肽(neurotrophic peptides)可通過(guò)飽和運(yùn)輸系統(tǒng)穿越BBB，堿性成纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor)可能通過(guò)吸附胞吞的作用跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。EGF是通過(guò)結(jié)合一個(gè)170 kD的酪氨酸特異性蛋白激酶(tyrosine-specific protein kinase)來(lái)向腦內(nèi)運(yùn)輸?shù)腫10]。

1.3 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子(cytokine)具有調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫、細(xì)胞生長(zhǎng)以及損傷組織修復(fù)等多種功能。白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor)通過(guò)飽和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)或原位腦灌注跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)至腦內(nèi)[11]，可以改變NT-3的表達(dá)、減少少突細(xì)胞的死亡，也可用于改善盧伽雷病的癥狀[12]。

1.4 作用于攝食行為的多肽

一般情況下，瘦素(leptin, LP)會(huì)被完全轉(zhuǎn)移至大腦中，此類多肽是LP作用的主要受體。其在下丘腦的核團(tuán)上高度表達(dá)，而這些核團(tuán)具有調(diào)節(jié)攝食與體重的功能，在一些外周組織如心、肺、淋巴結(jié)中也有表達(dá)。短受體在多種外周器官中選擇性地表達(dá)[13]。這類多肽在體內(nèi)表達(dá)最廣泛，其他多肽如胰肽(pancreatic polypeptide)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone, CRF)是通過(guò)飽和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)[14]，甘丙肽樣肽(galanin-like peptide)[15]、食欲肽A(orexin-A)[16]等都是通過(guò)非飽和途徑轉(zhuǎn)運(yùn)的。

1.5 阿片肽

阿片肽是免疫系統(tǒng)中重要的調(diào)節(jié)因子，它幾乎作用于所有的免疫活性細(xì)胞，對(duì)不同亞類的細(xì)胞作用卻不盡相同，阿片肽可能是應(yīng)激引起免疫調(diào)節(jié)的介質(zhì)。阿片肽、甲硫腦啡肽都是通過(guò)肽傳輸系統(tǒng)-1(peptide transport system-1)轉(zhuǎn)運(yùn)的[17]，也可以通過(guò)改變化合物的理化性質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)[18]。

1.6 激素或其他蛋白

CRF是通過(guò)飽和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來(lái)影響垂體及下丘腦產(chǎn)生腦內(nèi)啡的[19]，在大腦中存在一個(gè)胰島素(insulin)的飽和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，受體相關(guān)蛋白(receptor-associated protein)也可以透過(guò)BBB轉(zhuǎn)運(yùn)至腦組織?？乖Y(jié)合片段(fragment of antibody binding,FAB)、單克隆抗體(monoclonal antibody,MAb)、IgG、白蛋白(albumin)、P-糖蛋白(P-glycoprotein)、腦啡肽、糖肽等蛋白也可通過(guò)改變BBB通透性或化合物的理化性質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)[20]。

2 多肽類物質(zhì)的轉(zhuǎn)移機(jī)制

外周注射入血的多肽類物質(zhì)透過(guò)BBB的機(jī)制主要是不飽和的跨膜擴(kuò)散，如δ-促睡眠肽(delta-sleep-inducing peptide，DSIP)及其類似物、類固醇類等藥物，跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)能力主要取決于藥物的脂溶性[5]。隨著研究的不斷深入，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，較脂溶性，氫鍵鍵能對(duì)多肽類物質(zhì)透過(guò)BBB的影響更大[21]，同一種多肽，氫鍵構(gòu)象的改變可引起氫鍵鍵能的改變[22]，所以親水性較強(qiáng)的DSPI也能跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)。某些多肽如亮氨酸腦啡肽、精氨酸加壓素、黃體生成素釋放激素等還可以通過(guò)飽和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來(lái)透過(guò)BBB，這種機(jī)制被稱為肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[23]，在BBB中，區(qū)域差異(大腦的不同區(qū)域)也會(huì)影響到的肽或蛋白質(zhì)向腦內(nèi)的傳輸[24]。大多數(shù)親水性多肽的擴(kuò)散能力是有限的，然而，選擇性飽和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)通常能夠更高效的運(yùn)輸一些親水性多肽[14]，轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制又可細(xì)分為吸附介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)、受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)、載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)等多種形式，吸附介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)中的胞吞作用的強(qiáng)弱與多肽的帶正電部分和帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面之間的靜電作用大小有關(guān)[25]。吸附介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)易受到聚L-賴氨酸、丹酰尸胺、魚精蛋白[26]等的抑制。受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)具有更高的親和力及底物特異性，但是傳輸能力較吸附介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)低[13]。載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)運(yùn)輸能力的強(qiáng)弱與具有交叉抑制活性的結(jié)構(gòu)性配體有關(guān)[14]。此外，依附于蛋白上的IGF及其聚合物也會(huì)影響多肽跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)的能力[6]。大腦內(nèi)不同區(qū)域的酶活力是不盡相同的，這就為我們提供了一種通過(guò)調(diào)節(jié)進(jìn)入大腦不同區(qū)域物質(zhì)的量來(lái)調(diào)節(jié)多肽類物質(zhì)穿越BBB的方法[27]。通常情況下，可能只有很少量的肽類物質(zhì)可以跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)至CNS內(nèi)，但足以引起一定的生理反應(yīng)。

3 改變大分子肽類藥物跨BBB能力的途徑

多肽或蛋白類藥物在CNS疾病的治療中具有一定的意義，經(jīng)常會(huì)因BBB的屏障作用難以在腦內(nèi)達(dá)到有效血藥濃度而影響藥物的療效。因此，提高藥物穿越BBB的能力顯得尤為重要。

3.1 滲透性BBB開放

最直接的方法就是對(duì)BBB進(jìn)行可逆性的開放[28]，最常用的方法是在頸動(dòng)脈注射如甘露醇、阿拉伯糖等高滲溶液(即滲透性休克)，能使伊文思藍(lán)跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)并對(duì)腦組織進(jìn)行染色，1988年Neuwelt等通過(guò)滲透性開放BBB的實(shí)驗(yàn)證明了FAB或MAb均可以通過(guò)此方法進(jìn)入腦組織，但同時(shí)，這種非特異性的方法也會(huì)讓一些有害物質(zhì)進(jìn)入到腦內(nèi)[20]。

3.2 改變藥物的理化性質(zhì)

多肽類物質(zhì)跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)的能力與多肽的親脂性、分子大小、氫鍵鍵能等有關(guān)。一般來(lái)說(shuō)，親脂性越強(qiáng)，穿透能力也越強(qiáng)，氫鍵鍵能越低，穿透能力越強(qiáng)，因此，可以通過(guò)改變多肽的物理化學(xué)性質(zhì)來(lái)提高多肽類藥物通過(guò)BBB的能力。一系列實(shí)驗(yàn)證明降低氫鍵鍵能可以提高P-糖蛋白(P-glycoprotein)的跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)量[29]，糖基化的方法可提高阿片肽跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)的量以期增加藥效[30]、腦啡肽、糖肽、阿片肽等通過(guò)聚乙二醇化[18]的方法可提高其跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)和IgG糖基化后的跨BBB能力均有明顯提高[21]，胰島素(insulin)、白蛋白(albumin)、IgG經(jīng)聚酰胺修飾后跨BBB的轉(zhuǎn)運(yùn)能力會(huì)大大增強(qiáng)[31]，脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體的應(yīng)用也是這一想法的延伸。另外，腦毛細(xì)血管內(nèi)皮帶有負(fù)電荷，因此可以使多肽帶正電荷以提高其跨BBB能力，總之，在改變多肽的物理化學(xué)性質(zhì)的同時(shí)要保留或增強(qiáng)其療效，需要進(jìn)行更加深入的研究。

3.3 借助藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體

將多肽與特殊的載體結(jié)合，可以提高其跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。最近十幾年，陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道，用腺相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，單純皰疹病毒以及牛痘病毒等作為載體CNS疾病，如神經(jīng)退行性疾病、腫瘤及中風(fēng)[32]，在此過(guò)程中用甘露醇打開BBB通道以增加轉(zhuǎn)運(yùn)的量[33]，病毒載體與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白相結(jié)合可以促進(jìn)背根神經(jīng)軸突到脊髓等細(xì)胞定位再生，如NT-3可借助腺病毒作為載體提高轉(zhuǎn)運(yùn)能力[34]。轉(zhuǎn)鐵蛋白、低密度脂蛋白、胰島素等及其受體、抗體也可以作為多肽類藥物跨BBB的轉(zhuǎn)運(yùn)載體[26, 35]，此外，如陽(yáng)離子化的人血清白蛋白 (human serum albumin)[36]、轉(zhuǎn)鐵蛋白的單克隆抗體OX26[37]都可以作為良好的腦藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體，最新的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞穿透肽(cell penetrating peptides, CPP)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transduction domain, PTD)能促進(jìn)細(xì)胞對(duì)其所攜帶的各種物質(zhì)的攝取[38]，因此將多肽類藥物制成納米顆粒并且通過(guò)與CPP或PTD的結(jié)合達(dá)到跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)的目的成為了一個(gè)研究熱點(diǎn)。

4 血腦屏障體外模型及體外裝置

BBB的結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，因此其通透性的研究常常借助體外模型來(lái)實(shí)現(xiàn)。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，可以將體外模型大致劃分為靜態(tài)模型和動(dòng)態(tài)模型兩種類型，這兩種類型又可以細(xì)分為不同的類型。

4.1 靜態(tài)模型

靜態(tài)模型根據(jù)所培養(yǎng)細(xì)胞種類的不同，大致可分為單層模型及共培養(yǎng)模型[39]，因其不能模擬在體內(nèi)環(huán)境下血液流動(dòng)產(chǎn)生的切應(yīng)力，故其更適用于研究信號(hào)通路、轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)、高分子篩以及結(jié)合親和力的測(cè)量、細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與內(nèi)環(huán)境間的相互作用等的研究，其突出的優(yōu)點(diǎn)為操作簡(jiǎn)單。

4.1.1 單層模型

將單一類型的內(nèi)皮細(xì)胞[40]如腦微血管細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells, BMEC)，培養(yǎng)于Transwell膜上所構(gòu)建的BBB模型，基本可模擬BBB功能，牛、豬等大型動(dòng)物細(xì)胞比大鼠更適合建立體外BBB模型[41]。單層模型根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)源的不同主要有腦微血管碎段模型[41]、MDCK細(xì)胞模型[42]、永生化細(xì)胞模型[43]、原代BMEC模型等。單層模型的關(guān)鍵是要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化，常見的純化方法有篩網(wǎng)過(guò)濾、差速貼壁及搖床振搖[44]、免疫磁珠純化、Percoll離心純化等[45]。

4.1.2 共培養(yǎng)模型

為避免單獨(dú)培養(yǎng)的細(xì)胞喪失BBB的活性，加入其他細(xì)胞尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞能更好地模擬在體環(huán)境[46]。下面以三種共培養(yǎng)模型舉例：(1)微血管內(nèi)皮細(xì)胞+星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型，其表現(xiàn)型較單層模型更接近于體內(nèi)生理狀態(tài)[47]，因此能較好地模擬在體環(huán)境，是目前應(yīng)用最廣泛的模型。(2)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞+星形膠質(zhì)細(xì)胞+周細(xì)胞共培養(yǎng)模型，由于加入了周細(xì)胞，較前一種模型可更好地模擬在體狀態(tài)，通過(guò)測(cè)量上皮電阻(trans-epithelial electric resistance, TEER)、熒光素鈉通透性、堿性磷酸酶及γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的表達(dá)等來(lái)評(píng)價(jià)屏障功能[48]。(3)原代培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞+周細(xì)胞模型，此模型缺少星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能支持，較少使用，可用于研究?jī)煞N細(xì)胞間的相互作用。此外，BMEC還可以與神經(jīng)元或其他細(xì)胞共培養(yǎng)制備BBB模型,如由BMEC與膠質(zhì)細(xì)胞、海馬神經(jīng)元共培養(yǎng)制備而成的靜態(tài)三維模型可用于藥物篩選。

4.2 動(dòng)態(tài)模型

在體內(nèi)正常生理狀態(tài)下，血流流動(dòng)產(chǎn)生切應(yīng)力，能夠影響內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能，降低單層腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)藥物的滲透率。下面介紹三種常見的能夠模擬切應(yīng)力的BBB體外模型：(1)錐板裝置模型，利用圓錐旋轉(zhuǎn)來(lái)產(chǎn)生一定的切應(yīng)力[49]，切應(yīng)力受角速度和錐角大小的影響。(2)體外BBB動(dòng)力學(xué)模型，模型中的中空纖維膜可產(chǎn)生一定的切應(yīng)力，同時(shí)模型中也可以共培養(yǎng)其他類型的細(xì)胞，用輸氣管系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)氣體交換來(lái)維持微環(huán)境的穩(wěn)定，可用于研究各種CNS疾病的病理生理學(xué)，如腦缺血再灌注損傷和癲癇等的改變[50]。(3)三維動(dòng)力學(xué)模型，該模型用變速泵輸入液體產(chǎn)生切應(yīng)力，切應(yīng)力的產(chǎn)生裝置由兩個(gè)互相垂直的中空纖維管組成，多孔膜內(nèi)外兩側(cè)接種細(xì)胞并放置多個(gè)Ag/AgCl電極[51]，輸氣管實(shí)現(xiàn)O2和CO2交換。其為轉(zhuǎn)運(yùn)遷移實(shí)驗(yàn)的首選，也可應(yīng)用于神經(jīng)血管的研究、BBB內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的研究[52]。

除以上所介紹的模型外，很多學(xué)者基于細(xì)胞層面進(jìn)行BBB體外模型裝置的研發(fā)，以期在體外條件下再現(xiàn)BBB的結(jié)構(gòu)、功能和特性，常見BBB體外模型優(yōu)缺點(diǎn)及其應(yīng)用詳見表1。

5 總結(jié)

外周與大腦的大部分交流要依賴BBB。隨著神經(jīng)科學(xué)、遺傳工程技術(shù)、多肽蛋白分子三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及多肽蛋白分子相互作用研究的不斷深入，將會(huì)有更多的治療CNS疾病的多肽或蛋白類物質(zhì)將被發(fā)現(xiàn)并開發(fā)成可用于臨床的藥物。每年有上千種具有生物活性的多肽類物質(zhì)從動(dòng)物或細(xì)菌中被提取出來(lái)，天然多肽又可以通過(guò)基因工程、酶工程、糖基化、納米化等方法進(jìn)行修飾或克隆，從而獲得更多的應(yīng)用，因此，為增強(qiáng)多肽類藥物跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，對(duì)藥物進(jìn)行必要的化學(xué)修飾將成為一個(gè)研發(fā)的熱點(diǎn)，相信在不久的將來(lái)，將會(huì)有更多的多肽類神經(jīng)系統(tǒng)藥物及給藥、釋藥系統(tǒng)被開發(fā)出來(lái)并用于臨床實(shí)踐。

表1 BBB體外模型裝置優(yōu)缺點(diǎn)及其應(yīng)用[53]Table 1 Advantages and disadvantages of BBB models in vitro and their application