劉夢雅，袁 慧，高 潔，王永麗，尹晶晶，王新鋼，劉 歡，李建國，秦秀軍

(中國輻射防護研究院，藥物毒理與放射損傷藥物山西省重點實驗室， 太原 030006)

目前，全球頭頸部及原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤人數(shù)逐年增多，放射治療仍是其主要治療手段，但放射治療在損傷腫瘤細胞的同時，也會不可避免的損傷照射范圍內(nèi)正常組織，引起認知功能損傷[1]。認知功能障礙可表現(xiàn)為學習、記憶、思維、信息加工處理、推理、判斷、語言表達等方面異常，嚴重影響患者生活質(zhì)量。電離輻射致認知功能損傷動物模型的建立可以對其發(fā)病機制、輻射防護劑的研制等的研究提供研究基礎。認知功能損傷模型的建立方法很多，包括化學物質(zhì)損傷、物理損傷、轉(zhuǎn)基因鼠模型以及老化鼠模型等[2]，本次研究主要根據(jù)本實驗室照射條件，在不同劑量照射后通過一系列指標對模型建立進行評估，以此來判斷模型建立的條件，為后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，5～6周齡，20只，體重140～170 g，中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號[SCXK(軍) 2012 -0004]，合格證號：0035516；動物飼養(yǎng)管理于中國輻射防護研究院GLP 中心屏障環(huán)境中，使用許可證號[SYXK(晉) 2013-0002]，按照中國輻射防護研究院GLP 中心實驗規(guī)范進行實驗操作。動物經(jīng)6 d檢疫后，按照體重隨機分為對照組(Control，C group)、10 Gy照射組(10 Gy IR group)、20 Gy照射組(20 Gy IR group)、30 Gy照射組(30 Gy IR group)，每組5只動物。本實驗經(jīng)中國輻射防護研究院實驗動物倫理委員會批準[IACUC201603-02]。在整個實驗的過程中，參與實驗者以“3R原則”作為指導原則，并給予實驗動物人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

GSH、MDA、8-OHdG檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；Elekta Synergy型直線加速器：英國Elekta有限公司；Morris水迷宮：中國醫(yī)學科學院藥物研究所； SN25776型酶標儀：美國Biotek公司；Histocentre 3型石蠟包埋機：英國Shandon公司；Finesse 325型石蠟切片機：英國Shandon公司；Excelsior全自動組織脫水機：英國Shandon公司；BX53型熒光顯微成像系統(tǒng)：日本Olympus公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 照射條件及方法

將已麻醉的 SD 大鼠固定于泡沫板上，用X射線模擬機進行定位，照射部位為頭部，身體其他部分用低熔點鉛模具遮蔽，于山西大醫(yī)院放療科給予劑量率為3 Gy/min的6 MeV電子線照射，大鼠背部面向放射源，源皮距1.0 m，分別按照10 Gy、20 Gy、30 Gy的照射劑量進行單次照射，照射完成后送回動物，并于中國輻射防護研究院GLP 中心動物房統(tǒng)一飼養(yǎng)管理。

1.3.2 大鼠發(fā)病情況觀察

在實驗的過程中，觀察記錄大鼠的發(fā)病情況及生存期。

1.3.3 Morris水迷宮試驗[3]

照射后一個月進行Morris水迷宮試驗(Morris water maze, MWM)，Morris水迷宮由黑色內(nèi)壁圓柱形水池和一個位置可移動和高度可調(diào)節(jié)的塑料站臺組成。直徑100 cm，高50 cm，池內(nèi)水深30 cm，加熱器將水加熱在(21±2)℃左右。水池標有東、南、西、北四個入水點，并將水池分為東北(NE)、東南(SE)、西北(NW)、西南(SW)四個象限，在SE象限正中距池邊緣20 cm處放一逃避平臺，平臺高29 cm,直徑為10 cm，此平臺表面有凸起便于動物站立，池中水沒過平臺1 cm左右，水池內(nèi)池壁有各種圖案為動物提供空間參照線索，便于大鼠定位平臺，水迷宮上方放置攝像機，計算機內(nèi)安裝軟件對大鼠游泳軌跡進行跟蹤記錄，完成后對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。(1)定位航行實驗(place navigation test)，在正式實驗開始前一天將大鼠放入未放置平臺的水池中自由游泳2 min，熟悉實驗環(huán)境。定位航行實驗周期為5 d，每天訓練1個時段，每個時段訓練4次，分別從4個象限的4個入水點入水，訓練前將平臺放在SE象限中，將大鼠面向池壁從入水點放入池中，對大鼠的游泳軌跡進行跟蹤記錄，并記錄其從入水到爬到平臺(四肢均在平臺上)的時間，此時間即為逃避潛伏期(escape latency，LT)。讓大鼠在平臺上休息數(shù)秒后放回籠中。如果大鼠在2 min內(nèi)未找到平臺，則由實驗人員將其引至平臺，其逃避潛伏期記為120 s。每一時間段內(nèi)4次逃避潛伏期的算數(shù)均數(shù)作為這一時間段的成績，并進行統(tǒng)計。(2)空間搜索實驗(spatial probe test)在定位航行實驗后進行，即第6天撤去平臺，任選一個入水點將大鼠放入池中，記錄1 min內(nèi)大鼠的游泳軌跡并進行分析。觀察分析其穿過原平臺所在位置的次數(shù)，記錄大鼠在原平臺象限停留時間、平臺象限游泳距離及穿越平臺次數(shù)，以檢測大鼠的空間記憶能力。

1.3.4 氧化應激損傷相關指標檢測

各組大鼠在照射30 d后處死取出腦組織，稱取200 mg，放入潔凈的勻漿管中，加入預冷的0.9%的生理鹽水，將組織放在冰上剪碎、勻漿，2500 r/min離心10 min，收集上清液分裝，-20℃中保存?zhèn)溆谩７謩e嚴格按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書檢測MDA、GSH和8-OHdG含量。

1.3.5 病理切片制作方法及HE染色

(1)制片：修取大腦，按常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片及HE染色。(2)脫水及包埋：取組織，經(jīng)自來水沖洗固定液，酒精梯度脫水后(70%、80%、95%Ⅰ、95%Ⅱ、100%Ⅰ、100%Ⅱ)，對組織進行透明(二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ)，浸蠟(石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ)后包埋。(3)切片：包埋后的組織3～5 μm切片，經(jīng)60℃烤片后染色。(4)染色：HE染色(二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫蠟、過100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%Ⅰ、95%Ⅱ、80%、70%的梯度酒精，蘇木素染色、分化、反藍、伊紅染色、過70%、80%、95%Ⅰ、95%Ⅱ、100%Ⅰ、100%Ⅱ梯度酒精)。(5)透明及封片：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明后樹膠封片，待鏡檢。之后對每組大鼠的大腦切片進行光鏡檢查、拍照。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠照射后一般狀態(tài)觀察

圖1 不同劑量照射后大鼠生存曲線Figure 1 Survival curves of the rats after irradiation at different doses

照射后觀察動物的一般狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在照后第2天30 Gy IR組有動物發(fā)生背毛不整齊，流涎等癥狀，照后第3天死亡。如圖1各組別生存曲線可以看出照后30天時，C組未見動物死亡，10 Gy IR組和20 Gy IR組動物死亡率為20%，30 Gy IR組動物死亡率為40%。由于單純照射大鼠頭部，故在照后各劑量組大鼠頭頸部出現(xiàn)不同程度的脫毛現(xiàn)象，結(jié)果如圖2所示，從圖中可以看出30 Gy IR組大鼠頭頸部出現(xiàn)嚴重的脫毛現(xiàn)象。

2.2 不同劑量照射后Morris水迷宮試驗結(jié)果

5 d的定位航行實驗結(jié)果如表1，從表中可以看出，時間因素(day)有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明逃避潛伏期有隨時間變化的趨勢；但時間和分組的交互作用沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明時間因素的作用不隨著分組的不同而不同。個體間變異部分的計算結(jié)果顯示，分組的P值小于0.05，說明分組因素起作用，各組潛伏期指標總體而言不同。30 Gy IR組在1～5 d的訓練期中，潛伏期時間均高于其余三組且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

第6天空間搜索實驗結(jié)果如表2所示，30 Gy IR組較C組原平臺象限停留時間顯著縮短(P<0.05)；穿越平臺次數(shù)顯著減少(P<0.05)；10 Gy IR組、20 Gy IR組、30 Gy IR組原平臺象限游泳距離較C組均顯著縮短(P<0.05)，且隨著劑量的增加，原平臺象限游泳距離逐漸縮短。

2.3 不同劑量照射對腦組織中內(nèi)源性抗氧化劑和氧化損傷的影響

從表3中可以看出，四組間的GSH、8-OHdG、MDA差異均具有統(tǒng)計學意義(F=3.718、2.918、2.617，P<0.05)，進一步進行兩兩比較，與C組相比，10 Gy IR、20 Gy IR和30 Gy IR組大鼠腦組織中GSH濃度降低，且30 Gy IR組與C組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與C組相比，10 Gy IR、20 Gy IR和30 Gy IR組8-OHdG、MDA濃度均升高，其中20 Gy IR和30 Gy IR組與C組MDA濃度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，30 Gy IR組與C組8-OHdG濃度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 不同劑量照射后大鼠頭頸部出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象Figure 2 Hair loss occurred at the head and neck of rats after irradiation at different doses

分組Groups不同時間逃避潛伏期(s)Escape latency at different times第1天 Day1第2天Day2第3天Day3第4天Day4第5天Day5Control group61.79±31.8330.17±13.8712.07±4.7310.22±3.536.35±1.4810 Gy IR group76.42±23.7327.05±10.2311.69±6.7416.50±11.449.36±6.2520 Gy IR group81.12±29.4415.18±9.356.11±1.699.25±3.888.06±6.3630 Gy IR group95.51±23.4165.52±31.60*32.73±23.50*29.52±8.68*20.80±9.16*

注：與對照組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control group，*P<0.05.

表2 不同照射劑量組大鼠Morris水迷宮空間探索實驗結(jié)果比較Table 2 Comparison of results of spatial exploration in the Morris water maze in rats with different doses of irradiation

注：與對照組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control group，*P<0.05.

表3 不同照射劑量組大鼠GSH、SOD、MDA、8-OhdG濃度比較Table 3 Comparison of GSH, MDA, and 8-OhdG concentrations in the rats irradiated at different doses of irradiation

注：與C組比較,aP<0.05。

Note. Compared with the control group,aP<0.05.

注：A：正常細胞形態(tài)；B：10 Gy IR組細胞形態(tài)；C：20 Gy IR組細胞形態(tài)D：30 Gy IR組細胞形態(tài)；圖中實線箭頭所指為凋亡小體，虛線箭頭所指為空染區(qū)。圖3 不同照射劑量組大鼠大腦病理組織學改變(HE，×200)Note. A shows normal cell morpholo Gy; B shows 10 Gy IR group cell morphology; C shows 20 Gy IR group cell morphology; D shows 30 Gy IR group cell morphology; the solid arrows in the figure refer to apoptotic bodies, and the dotted arrow indicates empty stained area.Figure 3 Histopathological changes in the brain tissues of rats after different doses of irradiation(HE staining)

2.4 不同劑量組照射后大鼠大腦海馬CA3區(qū)的病理改變

HE染色光學顯微鏡下觀察顯示：C組海馬CA3區(qū)神經(jīng)細胞基本觀察不到凋亡、壞死等病理改變，細胞形態(tài)正常，細胞連接緊密，且排列整齊。照射后大部分椎體層細胞胞漿皺縮、深染，細胞數(shù)量減少，層次紊亂，排列無序，稀疏、松散，細胞連接不緊密。10 Gy IR組(B)個別椎體層內(nèi)細胞可見凋亡小體，少量神經(jīng)細胞壞死、結(jié)構(gòu)消失。20 Gy IR組(C)和30 Gy IR組(D)組織結(jié)構(gòu)破壞較10 Gy IR組更加嚴重，出現(xiàn)組織細胞凋亡、壞死等顯著的病理改變。且30 Gy IR組(D)出現(xiàn)空染區(qū)，可見多個凋亡小體。

3 討論

近年來，隨著醫(yī)學腫瘤治療技術(shù)的快速發(fā)展，適形放療、伽瑪?shù)?、X-刀等放射治療手段的應用延長了患者生存期，但與此同時，對周圍正常細胞的照射會引起正常組織不可逆損傷，進而引起頭頸部腫瘤患者認知功能障礙的發(fā)生[4]，降低了患者的生存質(zhì)量。有研究表明海馬在人體大腦內(nèi)主要負責學習記憶功能，電離輻射可以通過損傷海馬的神經(jīng)元細胞使人海馬依賴性的學習記憶等認知功能受損[5-6]。而進一步研究顯示海馬區(qū)神經(jīng)再生障礙目前被認為是輻射致認知功能損傷的主要原因[7]，但機制尚不明確。電離輻射致認知功能損傷動物模型的成功建立是進一步研究損傷機制、預防治療手段的重要基礎。

水迷宮實驗是空間學習記憶相關研究的經(jīng)典實驗，可以評價動物的空間記憶能力，以此來判斷認知功能相關腦功能區(qū)是否受到損傷，Rola等[7]利用5 Gy X射線對21日齡雄性小鼠進行全顱照射后發(fā)現(xiàn)，照后1個月和3個月，水迷宮測試空間記憶能力明顯減退，表明幼年小鼠大腦經(jīng)照射后會對認知功能造成遠期傷害。另外，電離輻射對機體的損傷主要通過間接作用，即作用于機體大分子，使其發(fā)生電離，產(chǎn)生活性氧(ROS)，當ROS產(chǎn)生量大于機體可承受抗氧化能力后，會使機體產(chǎn)生氧化應激損傷[8]，因此與氧化應激相關的產(chǎn)物及內(nèi)源性抗氧化物的濃度變化可間接反映大腦經(jīng)照射后受損傷程度。電離輻射作用于機體的同時，機體組織形態(tài)結(jié)構(gòu)也會發(fā)生變化，不同部位會發(fā)生相應的組織病理損傷[9]，故病理組織切片的觀察也是判斷損傷的重要指標之一。本次研究對大鼠腦部進行不同劑量照射后，通過檢測以上指標，對建立的電離輻射致認知功能損傷動物模型進行評估，選擇合適的照射劑量建立實驗動物模型。

在本次實驗中，選擇三個劑量進行模型建立，通過觀察動物照射后的一般狀態(tài)、死亡率，空間記憶能力、病理組織切片和氧化應激指標的檢測、發(fā)現(xiàn)單次30 Gy照射成功引起了大鼠空間記憶能力的受損。氧化應激損傷相關指標檢測結(jié)果說明30 Gy使機體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化劑減少，氧化損傷產(chǎn)物增多，對機體造成了氧化損傷。HE染色切片發(fā)現(xiàn)20 Gy IR組和30 Gy IR組組織結(jié)構(gòu)破壞嚴重，出現(xiàn)組織細胞凋亡、壞死等顯著的病理改變，從組織病理學角度觀察到高劑量照射對組織的損傷，較為全面地驗證了本次試驗建立的動物模型。在臨床治療的過程中，為了減輕患者放療產(chǎn)生的并發(fā)癥，采用分割根治性化療，但由于實驗條件所限，本次實驗采用的是單次大劑量照射；另外在照射的過程中為了方便動物的固定與定位，將動物麻醉，這樣不能排除麻醉劑對實驗的影響，今后實驗人員在實驗研究的過程中會盡量模擬實際臨床治療條件，進一步設計動物的固定方式，避免麻醉劑對實驗的影響。

綜合以上各指標的檢測結(jié)果提示在本實驗室的條件下，對頭部進行30 Gy單次照射可以引起大鼠認知功能障礙，冀勝軍等[5,10]通過不同劑量的電子線對SD大鼠進行單次全顱照射發(fā)現(xiàn)，2 Gy和10 Gy全顱照射不足以引起大鼠在短時間內(nèi)發(fā)生急性認知功能障礙，30 Gy可以成功誘導大鼠發(fā)生急性認知功能障礙，與本次研究結(jié)果一致，與其不同的是本次實驗增加了20 Gy IR組，檢測到部分指標提示有放射性損傷，且本次實驗指標檢測均在照射后30 天檢測。本次電離輻射致認知功能損傷動物模型的成功建立為下一步的機制研究、輻射防護劑的研究提供了動物模型、奠定了良好的實驗基礎。