張永海

(信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院檢驗技術(shù)學(xué)院，河南 信陽 464000)

研究報道，中國胃癌(gastric cancer,GC)的新發(fā)病例數(shù)約占全球總數(shù)的46.8%，而死亡人數(shù)占全球胃癌死亡總數(shù)的47.8%，胃癌嚴(yán)重威脅人們的健康[1]。這種疾病早期癥狀并不明顯，而當(dāng)確診時常已為晚期，常伴有轉(zhuǎn)移和侵襲癥狀，術(shù)后統(tǒng)計5年生存率不到20%[2]。目前胃癌主要是以手術(shù)結(jié)合化療為主要治療手段，但缺點是復(fù)發(fā)率比較高，且化療藥物對自身傷害大，易引起并發(fā)癥。

漢黃芩素屬于黃酮類化合物，分子式為C16H12O5，是植物黃芩的主要活性成分之一，能夠從植物黃芩、滇黃芩等的根部提取。漢黃芩素被證實具有廣泛的生物活性，如抗炎、神經(jīng)保護、抗腫瘤等[3]，其抗腫瘤活性已成為國內(nèi)外的一個研究熱點。文獻報道，漢黃芩素具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞抗藥性、抑制腫瘤血管生成、促進腫瘤細胞死亡以及誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡等作用[4-6]。目前研究漢黃芩素抗腫瘤活性較多，但深度、廣度不夠，其主要作用機制并不清楚。本實驗采用不同濃度漢黃芩素觀察對胃癌細胞SGC7901增殖、遷移和侵襲的影響，并進一步探討了漢黃芩素可能作用機制，為治療胃癌提供實驗依據(jù)，報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

胃癌SGC-7901細胞使用含有10%胎牛血清和雙抗(100 mg/L鏈霉素和100 U/L青霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h首次后換液，以后每3 d換液一次，當(dāng)細胞融合度為70%～80% 時進行傳代及后續(xù)實驗。

1.2 主要試劑與儀器

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)為Bio-Rad公司產(chǎn)品；引物由上海生工生物技術(shù)公司合成；TRIzol試劑為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；Real-time PCR試劑盒為Fermentas公司產(chǎn)品；人胃癌細胞株SGC-7901購自中國科學(xué)研究院上海細胞研究所。BCA試劑盒購自碧云天公司；漢黃芩素購自成都曼思特生物科技有限公司(質(zhì)量分數(shù)>98%)； ICAM-1、MMP-9、MMP-2、TIMP-2抗體購自Santa Cruz公司；實時熒光定量 PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 MTT法檢測

將對數(shù)生長期的SGC-7901胃癌細胞采用胰蛋白酶進行消化，接種于96孔培養(yǎng)板(1×105/mL)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)24 h后，對照組加入0.1% DMSO，用漢黃芩素 (20、50、100 μmol/L)處理SGC-7901胃癌細胞，分別培養(yǎng)24、48、72 h。每組設(shè)6個復(fù)孔。在各組實驗結(jié)束前，加入20 μL MTT培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，于室溫加入DMSO振蕩10 min溶解結(jié)晶，采用酶標(biāo)儀檢測波長570 nm吸光度值(A值)，實驗重復(fù)3次。

1.3.2 劃痕實驗

將SGC7901細胞種入6孔板內(nèi)(密度4×105/mL)，等待細胞長滿后采用PBS清洗，沿孔板底部劃一條直線，PBS 清洗并去除細胞碎片后，對照組加入等量的0.1%二甲基亞砜培養(yǎng)基，而將含不同濃度漢黃芩素(20、50、100 μmol/L) 的培養(yǎng)基加入至6孔板中，倒置顯微鏡下拍攝并確定劃痕邊緣區(qū)域及相對距離。實驗重復(fù)3 次。

1.3.3 Transwell實驗

將 Matrigel 膠稀釋后鋪于Transwell 小室上層內(nèi)(冰上操作)，室溫過夜。取在對數(shù)生長期的胃癌細胞按照每孔1 × 105種入 24 孔板 Transwell 中，孵育過夜，待細胞貼壁后，Transwell 小室的上室加入200 μL 含不同濃度漢黃芩素(0、20、50、100 μmol/L)的無血清培養(yǎng)基，而將 600 μL 含15% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基加入至Transwell 下室內(nèi)。常規(guī)培養(yǎng) 48 h 后，4% 多聚甲醛固定Transwell小室底面細胞。結(jié)晶紫染色 10 min，PBS 漂洗5 min共3次，在倒置顯微鏡下隨機取3個視野觀察并計數(shù)。

1.3.4 流式細胞儀檢測細胞周期

取對數(shù)生長期的SGC-7901胃癌細胞，以每孔3×105接種于6 孔板，用不同濃度漢黃芩素(0、20、50、100 μmol/L) 作用于胃癌細胞 48 h，胰酶消化收集細胞，PBS 洗滌后制備成細胞懸液，4℃過夜(加入預(yù)冷75%乙醇)，PBS清洗2次后棄上清，加入 PI 工作液冰浴避光染色，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

不同濃度漢黃芩素(0、20、50、100 μmol/L)孵育胃癌細胞(每孔3×105) 48 h后，用預(yù)冷的 PBS 洗滌 2 次，按照FITC AnnexinⅤ凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，依次加入5 μL PE Annexin V和 5 μL 7-AAD，混勻后避光孵育15 min，進行流式細胞儀檢測，重復(fù)3次。

1.3.6 RT-qPCR檢測MMP9、MMP2、ICAM-1表達水平

收集不同濃度漢黃芩素(0、20、50、100 μmol/L)處理SGC7901細胞48 h后，按照Trizol試劑盒說明書分別提取細胞總RNA，并測定濃度，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄 cDNA合成，反應(yīng)條件如下: 預(yù)變性95℃5 min，95℃變性30 s，56℃退火30 s，74℃延伸30 s，循環(huán) 40次。實時熒光使用 ABI PRISM 7500 Sequence Detector 檢測。引物由上海生工生物技術(shù)公司設(shè)計并合成，ICAM-1上游引物序列:5′-AGTCTG GCCCACGGACCAT-3′，下游引物:5′-CCAGTTTGTCTCTCCCTG -3′。MMP2上游引物：5′-TCAGTCGATCACTAGCGTCAAT-3′；下游引物：5′-CTAACTTCTCCCCACAGGGA-3′。MMP9上游引物：5′-GCCGTGT ATGT GTCTA CTCC T-3′；下游引物：5′-GCTCTCTCCCAATCTTCTGG-3′。TIMP-2上游引物序列:5′-AGCCATTGTCGGAGCCCAC-3′，下游引物:5′-CCTCTCTTGCCTGCAGTT-3′。以GAPDH蛋白為內(nèi)參，上游引物: 5′-GGATCCCTCCAGAGCG AAAAT-3′，下游引物: 5′-GTCATACTTCTGCTGTTG CATGG-3′。用系統(tǒng)軟件進行結(jié)果分析：樣品的相對表達用2-ΔΔCt表示。

1.3.7 Western blot檢測

收集不同濃度漢黃芩素(0、20、50、100 μmol/L)處理SGC7901細胞48 h后，用預(yù)冷PBS溶液清洗，加入蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液后冰浴，高速離心，對上清液采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品和加樣緩沖液混合煮沸變性，進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳條件：濃縮膠恒壓60 V 約 30 min，分離膠120 V 約90 min。轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，2.5%脫脂奶粉封閉2 h，加適量一抗MMP9、MMP2、ICAM-1在4℃孵育過夜后，加入二抗室溫震蕩孵育2 h，經(jīng)ECL顯色后膠片曝光顯影。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測胃癌細胞增殖

用漢黃芩素(20、50、100 μmol/L)分別刺激SGC-7901細胞 24、48、72 h后，與對照組比較，不同濃度漢黃芩素可顯著抑制SGC-7901細胞的增殖，且抑制率呈濃度和時間依賴性 (P<0.05)，見表1。

2.2 肝癌細胞劃痕實驗比較

處理48 h后，不同濃度漢黃芩素(0、20、50、100 μmol/L)對SGC-7901細胞遷移距離(mm)影響分別為(1.44±0.46)、(1.24±0.33)、(0.90±0.25)、(0.78±0.24)。與對照組比較，各濃度漢黃芩素組48 h后SGC-7901細胞遷移距離明顯下降(P<0.05)。見圖2。

2.3 Transwell實驗結(jié)果

Transwell 侵襲實驗結(jié)果顯示，0、20、50、100 μmol/L的漢黃芩素作用于SGC-7901細胞 48 h 后穿膜細胞數(shù)分別為(350±42)、(287±30)、(210±27)、(164±31)。與0 μmol/L的漢黃芩素組相比，各濃度漢黃芩素組均降低了穿膜細胞數(shù)(P<0.05，)，且呈一定的濃度依賴性。見圖3。

表1 漢黃芩素對SGC-7901細胞增殖的影響Table 1 Effects of wogobin on proliferation of the SGC-7901 cells in vitro

注：與對照組比較，*P<0.05；與同組24 h比較，#P<0.05；與同組48 h比較，ΔP<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the same group at 24 h,#P<0.05. Compared with the same group at 48 h,ΔP<0.05.

注： A-D為處理48 h時，A：對照組；B：20 μmol/L漢黃芩素組；C：50 μmol/L漢黃芩素組；D：100 μmol/L漢黃芩素組。圖1 胃癌細胞劃痕實驗比較(×100)Note. A-D for 48 h treatment; A. control group; B. 20 μmol/L wogobin group; C. 50 μmol/L wogobin group; D:100 μmol/L wogobin group.Figure 1 Comparison of the scratch test results for gastric cancer cells

注：A. 對照組；B. 20 μmol/L漢黃芩素組; C. 50 μmol/L漢黃芩素組; D.100 μmol/L漢黃芩素組圖2 不同濃度漢黃芩素處理后胃癌細胞Transwell實驗結(jié)果(×400)Note. A. control group, B. 20 μmol/L wogobin group, C. 50 μmol/L wogobin group, D. 100 μmol/L wogobin group.Figure 2 Results of transwell assay of gastric cancer cells treated with different concentrations of wogobin

2.4 漢黃芩素對胃癌細胞周期影響

與空白對照組比較，漢黃芩素能夠增加S期細胞比例，減少 G2/M 期細胞比例(P<0.05)。這提示漢黃芩素可將SGC-7901細胞阻滯在S期。

注：A. 對照組；B. 20 μmol/L漢黃芩素組; C. 50 μmol/L漢黃芩素組; D.100 μmol/L漢黃芩素組；與對照組比較，aP<0.05。圖4 漢黃芩素對SGC-7901細胞凋亡的影響Note. A. control group, B. 20 μmol/L wogobin group, C. 50 μmol/L wogobin group, D. 100 μmol/L wogobin group. Compared with the blank control group, aP < 0.05.Figure 4 Effect of wogobin on apoptosis in the SGC-7901 cells

2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

不同劑量的漢黃芩素能明顯促進人胃癌 SGC-7901 細胞的凋亡。與對照組比較，漢黃芩素隨著劑量的增加，細胞凋亡率也明顯增加 (P<0.05)，說明其作用呈濃度依賴性。

注：與對照組比較，aP<0.05圖3 漢黃芩素對SGC-7901細胞周期的影響Note. Compared with the control group, aP < 0.05.Figure 3 Effect of wogobin on cell cycle of the SGC-7901 cells

2.6 漢黃芩素對SGC-7901細胞ICAM-1、TIMP-2、MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表達水平的影響

RT-qPCR分析結(jié)果顯示：與對照組相比，漢黃芩素組(20、50、100 μg/mL)細胞內(nèi)ICAM-1、MMP-2、MMP-9的 mRNA表達水平均下降(P<0.05)，而TIMP-2 mRNA表達水平上升(P<0.05)；Western blot檢測結(jié)果顯示：漢黃芩素組(20、50、100 μg/mL)細胞內(nèi)ICAM-1、MMP-2、MMP-9的蛋白表達水平與對照組相比明顯下降，有顯著性差異(P<0.05)，而與TIMP-2 相比蛋白表達水平上升(P<0.05)，Western blot和RT-qPCR檢測結(jié)果基本一致。

3 討論

惡性腫瘤具有的重要特征是轉(zhuǎn)移，腫瘤轉(zhuǎn)移導(dǎo)致超過90% 癌癥患者死亡[8]。癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素是惡性細胞的侵襲和遷移，與此同時，惡性細胞不斷增殖、分離、轉(zhuǎn)移，黏附于血管壁上，建立一個新的微環(huán)境，最終轉(zhuǎn)移擴散至其他部位[9]。近 50% 胃癌患者會發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，結(jié)果導(dǎo)致預(yù)后不良，而且死亡率較高[10]。因此在胃癌的治療中抑制癌細胞轉(zhuǎn)移活力具有十分重要的作用。

表2 漢黃芩素對SGC7901細胞TIMP-2、ICAM-1、MMP-2和MMP-9 mRNA的影響Table 2 Effects of wogobin on TIMP-2, ICAM-1, MMP-2, and MMP-9 mRNA in the SGC7901 cells

注：與對照組相比，*P<0.05。

Note. Compared with the control group，*P<0.05.

表3 漢黃芩素對SGC7901細胞TIMP-2、ICAM-1、MMP-2和MMP-9蛋白的影響Table 3 Effects of wogobin on TIMP-2, ICAM-1, MMP-2, and MMP-9 proteins in the SGC7901 cells

注：與對照組相比，*P<0.05。

Note. Compared with the control group，*P<0.05.

注：1: 對照組，2： 20 μmol/L漢黃芩素組 3: 50 μmol/L漢黃芩素組4:100 μmol/L漢黃芩素組。圖5 漢黃芩素對SGC7901細胞ICAM-1、TIMP-2、MMP-2和MMP-9 蛋白表達水平影響Note.1. Control group, 2. 20 μmol/L wogobin group, 3. 50 μmol/L wogobin group, 4. 100 μmol/L wogobin group.Figure 5 Effects of wogobin on TIMP-2, ICAM-1, MMP-2 and MMP-9 proteins in the SGC7901 cells

從中藥黃芪中提取的漢黃芩素是一種黃酮類化合物，能夠通過多種方式協(xié)同抗癌劑促進腫瘤細胞死亡、抑制腫瘤血管生成及誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡等作用。漢黃芩素對肺癌細胞、骨肉瘤細胞、及乳腺癌[11-12]等腫瘤細胞均能促進凋亡、抑制生長等作用。腫瘤惡性程度及發(fā)病的主因與腫瘤細胞的增殖、遷移及轉(zhuǎn)移等能力密切相關(guān)，其相關(guān)作用機制復(fù)雜包括各種生長因子、腫瘤細胞微環(huán)境、及細胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等[13-14]。

本研究觀察漢黃芩素作用SGC7901胃癌細胞是否有抗胃癌作用，結(jié)果顯示漢黃芩素能抑制SGC7901胃癌細胞的增殖，且呈濃度和時間依賴性；惡性腫瘤具有的重要特征是遷移及侵襲能力，這也是惡性腫瘤患者主要死因及影響化療效果的主要因素。本研究通過劃痕實驗及 Transwell實驗觀察漢黃芩素對SGC7901胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響，結(jié)果顯示漢黃芩素能夠抑制 SGC7901 胃癌細胞的遷移和侵襲，呈濃度依賴性；在腫瘤發(fā)生過程中會產(chǎn)生細胞周期變化及凋亡異常，本實驗采用流式細胞儀分析漢黃芩素對 SGC7901 細胞的抑制作用，結(jié)果顯示，與空白對照組比較，漢黃芩素能夠增加S期細胞比例，減少 G2/M 期細胞比例，這提示漢黃芩素可將SGC-7901細胞阻滯在S期。同時漢黃芩素處理后，SGC7901細胞凋亡率顯著升高，且呈濃度依賴性，提示漢黃芩素具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用。

移動、蛋白降解和細胞黏附是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移主要過程，而細胞黏附作用一般認為是其始動因素，細胞間黏附分子-1(ICAM-1)能夠在胞外基質(zhì)間、細胞與細胞間介導(dǎo)產(chǎn)生黏附的作用，同時文獻報道ICAM-1在癌轉(zhuǎn)移與胃癌細胞中高表達具有相關(guān)性[15]。Western blot和RT-qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，漢黃芩素(20、50、100 μg/mL)作用SGC7901胃癌細胞后，ICAM-1表達明顯下調(diào)；癌細胞的侵襲、遷移與轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白密切聯(lián)系，這些轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白具有降解、破壞細胞外基質(zhì)的作用。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs) 具有調(diào)控腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用，是降解細胞外基質(zhì)的鋅依賴蛋白水解酶，其中MMP-2、MMP-9與腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16-17]。金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)是在體內(nèi)分布廣泛的 MMPs 的抑制劑。研究顯示, 金屬蛋白酶抑制劑能以非共價穩(wěn)定結(jié)合處于活化狀態(tài)的 MMPs, 抑制MMPs對基底膜的降解[18]。在本研究中，漢黃芩素(20、50、100 μg/mL)作用SGC7901胃癌細胞后，Western blot和RT-qPCR檢測結(jié)果顯示細胞內(nèi)MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白逐漸表達下降，而TIMP-2 mRNA和蛋白表達逐漸上升，這說明漢黃芩素具有濃度依賴性抑制SGC7901胃癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

實驗結(jié)果表明，漢黃芩素不僅具有抑制SGC7901胃癌細胞增殖、遷移和侵襲能力，還能誘導(dǎo)其凋亡。而RT-qPCR和Western blot檢測結(jié)果表明，漢黃芩素能夠抑制 ICAM-1，MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表達，同時TIMP-2 mRNA和蛋白表達逐漸上升，這些說明漢黃芩素具有抑制胃癌細胞轉(zhuǎn)移的能力。漢黃芩素具有廣泛抗腫瘤活性，毒副作用小，有可能成為治療胃癌的臨床藥物，本實驗為進一步的新藥研發(fā)提供基礎(chǔ)研究。