郭倫愛, 戴迎春, 陳俊銳, 段文韜, 張緒富*

(1.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院流行病學系，廣州 510515)

人諾如病毒(human noroviruses,HuNoVs)是全球范圍內(nèi)引起成人和兒童非細菌性急性胃腸炎暴發(fā)流行的重要病原體，其中60%～90%的HuNoVs急性胃腸炎由GII.4型HuNoVs導致[1]。HuNoVs可在所有年齡段、不同的半密閉場所(幼兒園、學校、餐館醫(yī)院等)引起暴發(fā)。據(jù)美國疾病控制中心統(tǒng)計，美國每年至少有2300萬HuNoVs導致的病毒性胃腸炎病例，其中800例死亡，發(fā)展中國家每年因HuNoVs感染而死亡的5歲以下兒童高達21.8萬[2-3]。由于至今尚未建立有效的HuNoVs體外培養(yǎng)系統(tǒng)和小動物感染模型，抗HuNoVs藥物和疫苗研究進展緩慢[4]。

樹鼩(Tupaiabelangeri，tree shrew)作為靈長類動物的近親，在生理解剖、神經(jīng)發(fā)育、病毒感染特性及心理應激模式等方面與靈長類甚至人類之間存在高度的相似性，諸多報道顯示樹鼩能感染人類甲肝、乙肝、丙肝、輪狀、柯薩奇和皰疹等病毒[5-6]，目前已被廣泛應用于醫(yī)學生物學領域。樹鼩能否感染HuNoVs尚未見報道，本研究首次探索樹鼩作為HuNoVs感染小動物模型的可行性并分析討論了該領域存在的困難和未來的研究方向。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

實驗用滇西亞種普通級雄性樹鼩由中國科學院昆明動物研究所提供[SCXK(滇)K2017-0003]，6月齡，體重約120～150 g，動物實驗在中國科學院昆明靈長類研究中心進行[SYXK(滇)K2017-0008]，動物單只飼養(yǎng)于不銹鋼籠中，室溫維持在25℃～27℃，人工光照12 h/d，喂以蘋果、面包蟲、雞蛋和混合飼料，籠舍定期清潔消毒，實驗過程符合倫理委員會要求[IACUC編號：17006]，并按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.1.2 HuNoVs糞便懸液及正常人群唾液樣本

實驗所用HuNoVs糞便懸液來自于醫(yī)院臨床患者，由本課題組采集保存，經(jīng)RT-PCR檢測和基因序列分析鑒定為HuNoVs GII.4型2010和Sydney株[7]。正常人群唾液樣本采集自南方醫(yī)院兒科臨床患者[8]。

1.2 主要試劑與儀器

QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑盒(52904)，one-step RT-PCR試劑盒(210210)購自QIAGEN 公司，純化豚鼠抗NoV多抗血清由美國辛辛那提兒科研究中心Jiang Xi教授提供，Blood Group A Antigen(sc-59459)，Blood Group B Antigen(sc-52371)，Blood Group H Antigen(sc-52329)，Lewis a(sc51512)、Lewis b(sc51513)、Lewis x(sc59471)、Lewis y(cas82993)血型抗原購自德國Santa Cruz公司， HRP-羊抗鼠IgG(A21020)購買于AbbKine公司。免疫組化試劑盒(SA1020), HRP-羊抗鼠IgM(BA1075)購自武漢博士德生物科技公司，碳酸氫鈉(CC0121)購自北京鼎國生物公司,GeneRuler 1 kb DNA Ladder(SM0312)購買于賽默飛公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HuNoVs灌胃攻毒及樣品采集

15只樹鼩被隨機分為A、B、C 3組，每組5只。HuNoVs糞便懸液灌胃前采集唾液50 μL于清潔試管內(nèi)用于人類組織血型抗原(histoblood group antigen，HBGAs)檢測。HuNoVs攻毒試驗方法參考文獻[9-10]：樹鼩適應性飼養(yǎng)3 d，第4天先進行中和胃酸處理，即每只灌服500 μL 100 mmol/L NaHCO3溶液，根據(jù)文獻方法[11]進行灌胃攻毒。A、B兩組分別灌服GII-4 2010株和Sydney株糞便懸液(200 μL糞便懸液用800 μL PBS稀釋，約2×105viral RNA copies)，C組(對照組)灌服1000 μL PBS。攻毒后每天觀察樹鼩飲食、活動、毛發(fā)、精神狀態(tài)和糞便性狀，每天早晨收集糞便樣本約1 mL用于病毒檢測，并參照下表進行腹瀉評分。

表1 腹瀉評分表Table 1 Diarrhea score

1.3.2 糞便樣本中HuNoVs RNA檢測

參照本室建立的穩(wěn)定檢測方法[12]，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑盒提取糞便標本RNA，以提取所得的RNA 為模板，使用one-step RT-PCR試劑盒，按照說明書進行RT-PCR 擴增。分別設置陽性和陰性對照，擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照記錄。

1.3.3 小腸組織病理標本制作觀察以及免疫組化法檢測HuNoVs抗原

攻毒后第7天處死樹鼩，剪取回腸1 cm，10%甲醛固定2 h進行石蠟包埋。蠟塊修整后經(jīng)切片機切成5 μm薄片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察小腸組織炎癥細胞浸潤及絨毛上皮損傷等情況并拍照。石蠟切片常規(guī)脫蠟和抗原修復處理后，5% BSA 37℃封閉20 min，1∶250豚鼠抗NoV多抗血清4℃過夜，HRP-羊豚鼠IgG二抗37℃ 20 min，滴加SABC后DAB顯色，脫水、透明、中性樹脂封片后顯微鏡下觀察。

1.3.4 唾液HBGAs表型鑒定[8]

樹鼩唾液100℃煮沸10 min后用PBS1∶10稀釋，包被于96孔酶聯(lián)板，5%脫脂奶-PBS封閉，分別加入單抗A、B、H、Lewis a、 Lewis b、Lewis x、Lewis y(1∶300稀釋)4℃過夜，加入二抗HRP-羊抗鼠IgG或IgM(1∶3000)后，TMB底物顯色，磷酸溶液終止后酶標儀測定OD值，記錄結果。

2 結果

2.1 樹鼩攻毒后的癥狀觀察和腹瀉情況

HuNoVs灌胃攻毒樹鼩后，GII-4 2010株組(A組)和Sydney株組(B組)未觀察到精神萎靡、體毛蓬松、飲食減少等感染癥狀，與對照組相比無差異。三組所有樹鼩均無明顯腹瀉情況發(fā)生，糞便呈粘稠均勻或半液狀均勻狀態(tài)。

2.2 樹鼩糞便HuNoVs RNA檢測結果

收集HuNoVs攻毒后連續(xù)7 d的樹鼩糞便樣本，RT-PCR法檢測HuNoVs，結果顯示三組105份糞便標本均為陰性，圖1為部分代表性樣品RDRP區(qū)域基因的RT-PCR結果，其中陽性對照組條帶大小符合預期(387 bp)，其余無條帶。

2.3 小腸組織光鏡觀察和免疫組化結果

HuNoVs灌胃攻毒7 d后處死樹鼩，取小腸組織進行HE染色，結果顯示三組小腸組織病理改變均不明顯，小腸絨毛光整、平滑，固有層無炎癥細胞浸潤，腸腔無滲出物，結果見圖2。進一步利用免疫組化法檢測小腸組織中HuNoVs抗原，陽性表達者將在胞膜和胞漿中呈棕黃色，結果顯示三組在任意位置均未檢測到病毒抗原的存在，結果見圖3。

注：M：DNA marker(1 kb)， 1∶2010株， 2：Sydney株， 3：陰性對照， 4～6：對照組， 7～9：感染A組， 10～12感染B組。圖1 樹鼩糞便懸液部分樣品RDRP區(qū)域基因的RT-PCR結果Note. M: DNA marker (1 kb), 1∶2010 strains, 2: Sydney strains, 3: Negative control, 4-6: Control group, 7-9: Infection group A, 10-12: Infection group B.Figure 1 RT-PCR results of the amplification of the RDRP region

2.4 樹鼩唾液HBGAs分型結果

近年大量分子流行病學研究以及利用HuNoVs對志愿者進行攻擊的實驗表明，HBGAs是HuNoVs的天然受體或配體，這可能是HuNoVs在人體腸道中受體吸附的一個重要機制。為了進一步明確樹鼩外周組織中是否表達HBGAs，對三組15份樹鼩唾液進行了HBGAs測定，結果均為陰性，未檢測到ABH和Lewis抗原，正常人群的6份唾液中均有不同型別的HBGAs表達，結果見圖4。

圖3 樹鼩小腸組織免疫組化觀察(HE染色，×100)Figure 3 Examination of small intestine tissues from tree shrews challenged with HuNoVs (HE staining)

注：1～2：對照組，3～5：感染A組，6～8：感染B組，9～14：正常人群對照。圖4 樹鼩唾液中HBGAs的檢測結果Note. 1-2：Control group，3-5: Infection group A，6-8：Infection group B，9-14：Normal human population control group.Figure 4 Distribution of HBGAs in saliva from tree shrews

3 討論

HuNoVs作為急性病毒性胃腸炎的重要病原體，在全球范圍內(nèi)帶來了沉重的醫(yī)療負擔和社會公共衛(wèi)生問題[13]。有效的動物模型是HuNoVs疫苗和抗病毒藥物研發(fā)的重要環(huán)節(jié)和保障，也是研究病毒感染進程和致病機理的主要手段。長期以來，HuNoVs小動物感染模型研究仍是HuNoVs領域的熱點和難點。

近年來，研究證實悉生豬是目前最有前景的HuNoVs動物感染模型[9-10]。悉生豬在胃腸解剖學結構、生理學、免疫系統(tǒng)等方面與人具有相似的特征，在粘膜表面也存在HBGAs，將其感染人HuNoVs后能導致腹瀉、病毒血癥，并出現(xiàn)糞便排毒和血清轉換，另外，悉生牛動物模型中也證實類似結果[14]。然而，這些悉生大動物飼養(yǎng)繁殖難度大、操作繁瑣、價格昂貴等缺點限制了其廣泛推廣運用[15]。樹鼩是一種形似松鼠的小型哺乳動物，具有個體小、成本低、易操作等優(yōu)點，蛋白質序列同源比對發(fā)現(xiàn)樹鼩與人的蛋白質相似度高于嚙齒類動物，同時一些重要神經(jīng)系和免疫系統(tǒng)信號通路系統(tǒng)與靈長類動物高度相似，作為實驗動物在生命醫(yī)學領域已被使用30多年。樹鼩有諸多與人類相似的病毒相關免疫因子(如淋巴細胞、細胞因子、PRRs及 MHC等)[16]，許多感染特性與人類相似，多項研究表明樹鼩能感染人類甲肝、乙肝、丙肝、輪狀、皰疹、腺病毒等[17-20]。尤其是樹鼩能感染輪狀病毒的報道啟示相關人員[21]：樹鼩能否感染HuNoVs非常值得探索和實踐。

本研究首次以HuNoVs的優(yōu)勢流行株GII-4 2010株和Sydney株灌胃攻毒樹鼩，探索了其作為HuNoVs感染模型的可行性。遺憾的是，從樹鼩的腹瀉癥狀、糞便排泄物的病毒檢測，以及小腸組織的病理學和病毒抗原等方面都沒有發(fā)現(xiàn)HuNoVs感染的證據(jù)。研究表明10～100個諾如病毒顆粒即可導致人感染，HuNoVs的悉生豬動物模型[9-10]以及應用悉生豬動物模型進行的疫苗評價試驗[11]研究表明:4～5日齡悉生豬灌胃攻毒量約3×104viral RNA copies，本研究攻毒量為2×105viral RNA copies，相當于悉生豬模型中病毒量的5～6倍，所以本研究的攻毒劑量理論上足夠感染樹鼩。結合近年來HuNoVs感染機制的最新進展，研究人員分析了樹鼩未能感染HuNoVs的可能相關因素，并思考了今后的研究方向：

一、大量分子流行病學和分子生物學實驗研究證實腸道黏膜上的HBGAs是HuNoVs的病毒受體[15]。HBGAs在腸道上皮細胞上表現(xiàn)為ABH和 Lewis抗原，對應在紅細胞上表現(xiàn)為分泌型(A、B、O血型)和非分泌型。目前研究發(fā)現(xiàn)至少共有8 種HuNoVs和組織-血型抗原作用的方式，并可歸為2大類：A/B結合型(分泌型結合型)和Lewis結合型(非分泌型結合型)[22-23]。樹鼩唾液中未檢測到HBGAs血型物質可能與樹鼩對HuNoVs不易感有關。今后建立遺傳背景清晰、HBGAs遺傳成分穩(wěn)定的種群或品系可能是HuNoVs感染樹鼩小動物模型的重要方向。

二、悉生豬(和牛)的HuNoVs動物感染模型[9-10, 14]的成功提示動物腸道的無菌環(huán)境可能也是一個重要因素。最新的研究表明陰溝腸桿菌能夠抑制HuNoVs感染悉生豬[24]，而且益生菌對HuNoVs感染具有較好的保護作用[25]。后續(xù)選用無菌級的SPF樹鼩(悉生樹鼩或者實驗前后對樹鼩進行抗菌處理)探索HuNoVs感染小動物模型的努力仍值得期待。