秦秀德,張麗娜, 劉 琛, 車若梅, 李斯琪,李新悅, 趙 勃, 張國偉*

(1.深圳市中醫(yī)院/廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院， 廣東 深圳 518000；2.河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 河北 保定 071002)

腦卒中是由腦血管阻塞或破裂引起的急性疾病，2013年卒中是第二大常見死因和第三種最常見的殘疾原因。在全球范圍內(nèi)，2013年有近2570萬中風(fēng)幸存者(71%為缺血性腦卒中)，650萬中風(fēng)死亡(51%死于缺血性腦卒中)[1]。2015年，平均每3 min 45 s，就有1人死于腦卒中。在美國每19例死亡中約有一例死于腦卒中[2]。缺血再灌注損傷是腦血管疾病中的重要研究方向，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)在缺血再灌注損傷中可能處于主要地位[3]。強(qiáng)烈或長時(shí)間的ERS使機(jī)體內(nèi)GRP78 (glucose regulated protein, GRP78)高度表達(dá)，因此GRP78的表達(dá)水平可以作為ERS發(fā)生的標(biāo)志之一[4]。CHOP (C/EBP homologous protein, CHOP)是ERS特異的轉(zhuǎn)錄因子, 是由抗凋亡向促凋亡轉(zhuǎn)換的重要信號分子[5]，因此，CHOP一定程度上可反映ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平[6]。超敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein, CRP)是主要在肝臟內(nèi)合成的一種急性反應(yīng)時(shí)相蛋白，為炎癥的指標(biāo)，CRP與腦卒中風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)系[7]，因此研究CRP為缺血性腦卒中預(yù)防和治療研究開辟了新的領(lǐng)域。

紅花注射液具有抗缺血再灌注損傷與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用[8-9]。依達(dá)拉奉注射液是一種強(qiáng)效的輕自由基清除劑及抗氧化劑，腦梗死急性期患者給予依達(dá)拉奉，能有效改善神經(jīng)功能缺損，故以其作為實(shí)驗(yàn)的陽性對照組[10]。大腦中動脈栓塞(MCAO)模型與人類急性腦梗死病理生理過程最為接近，是目前用來評價(jià)急慢性腦缺血再灌注損傷藥物最為經(jīng)典的模型[11]。研究紅花注射液對大鼠MCAO(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子 GRP78、CHOP的表達(dá)以及超敏C反應(yīng)蛋白的影響，探討通過ERS途徑的紅花注射液治療急性腦梗死調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的作用機(jī)制，可為紅花注射液在防治腦梗死臨床應(yīng)用研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級雄性SD大鼠48只，體重230～270 g，10周齡，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK 2014-0004]提供。所有大鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境條件下保持3 d(溫度 (23±2)℃，濕度(55±5)%和12 h/12 h光照/黑暗循環(huán))，大鼠可自由飲水和進(jìn)食。所有動物實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)、手術(shù)、取材均在河北大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi) [SYXK(冀)2012-0048]進(jìn)行，均按照“河北大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理與使用原則”進(jìn)行處理，并經(jīng)動物保健機(jī)構(gòu)委員會批準(zhǔn)[IACUC-2016001]。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗GRP78多克隆抗體、鼠抗CHOP單克隆抗體(碧云天生物技術(shù)有限公司)；Trizol試劑盒、Quant cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技北京有限公司)；SYBR?Premix Ex TaqTMII(寶生物工程大連有限公司)；辣根酶標(biāo)記工作液、DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；大鼠超敏C反應(yīng)蛋白試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(北京博奧拓科技有限公司)；紅花注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司)；依達(dá)拉奉注射液(國藥集團(tuán)國瑞藥業(yè)有限公司)；熒光定量PCR儀(Applied Biosystem 7500 Fast)。

注：(a) 紅花注射液(批號：150903010) (b) 最高點(diǎn)顯示為羥基紅花黃色素A的值。圖1 紅花注射液及指紋圖譜Note. (a) Safflower injection (Batch Number:150903010)(b) Chemical fingerprint peak 9(S), hydroxysafflor yellow A.Figure 1 Safflower injection and its chemical fingerprint

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物模型建立

參考文獻(xiàn)制作大鼠MCAO模型[12]，雄性SD 大鼠，在 24℃～26℃室溫的實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng) 3 d，大鼠于晨 8 時(shí)給予食物 20 g，自由飲水。手術(shù)大鼠術(shù)前禁食 12 h，自由飲水，稱重，采用改良線栓線法制備腦缺血大鼠模型。40 mg/kg戊巴比妥鈉行腹腔注射麻醉，將大鼠四肢和牙齒用棉線繩固定好，消毒，正中切口，鈍性分離頸部肌肉，分離頸總動脈(common carotid artery, CCA)、頸外動脈(external carotid artery, ECA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery， ICA)，結(jié)扎 ECA 遠(yuǎn)心端、CCA 近心端。動脈夾夾閉 ICA，由 CCA 插入 MCAO 栓線，向頸內(nèi)動脈(ICA)推進(jìn)，至大腦中動脈(middle cerebral artery, MCA)，導(dǎo)致局灶性腦缺血。10-0 絲線縫合頸部切口。該模型為持續(xù)缺血模型，未進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組動物不插入 MCAO 栓線，術(shù)中嚴(yán)格控制室溫在 20℃～25℃。

1.3.2 動物分組及給藥

所有動物隨機(jī)分為4組，假手術(shù)組12只，模型組12只，紅花注射液組12只，依達(dá)拉奉注射液組12只。紅花注射液組造模6 h后，尾靜脈注射紅花注射液(1.83 mL/kg)。依達(dá)拉奉組大鼠造模6 h后，尾靜脈注射依達(dá)拉奉(5.67 mg/kg，溶于2 mL生理鹽水)。

1.3.3 評估神經(jīng)功能缺損程度和腦梗死面積

使用改良的Zea Longa標(biāo)準(zhǔn)評估所有動物的大鼠神經(jīng)損傷程度[10]，將其分為以下標(biāo)準(zhǔn)：0分，無缺陷；1分，不能伸展對側(cè)前肢；2分，對側(cè)前肢彎曲；3分，輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分，嚴(yán)重向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；5分，對側(cè)癱瘓。

將大鼠腦取出后于-20℃冰凍25 min，放入大腦切片器中將大腦均勻切成 2 mm 左右的薄片，置于制備好的1%TTC中染色，相機(jī)采集圖像資料，使用尼康Elements圖像處理軟件分析大腦梗死面積。然后用多聚甲醛溶液和組織保存液切片，封口。紅色區(qū)域是正常供血區(qū)，白色區(qū)域是梗死區(qū)。

1.3.4 免疫組化檢測方法

切片進(jìn)行脫蠟水化，分別用二甲苯溶液和不同濃度的乙醇溶液去除蠟，PBS 5 min沖洗3次?？乖迯?fù)，依次滴加一抗和二抗，并采取溫育處理。滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，滴加DAB顯色劑進(jìn)行顯色，自來水停顯，進(jìn)行脫水封片。采用BX43生物顯微鏡在×100和×400視野下觀察。在×400視野下觀察細(xì)胞形態(tài)和染色部位，在×100的視野下，每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野，測量海馬區(qū)CA1區(qū)，以細(xì)胞膜、胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，采用半定量積分法判斷結(jié)果。陽性細(xì)胞數(shù)<6%為0分，6%～25% 為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；陽性強(qiáng)度黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者積分相乘。0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(+ +)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.3.5 RT-qPCR技術(shù)檢測GRP78 mRNA、CHOP mRNA

取4℃冷凍保存的大鼠同一部位腦切片組織，用液氮和Trizol試劑提取總RNA，核酸蛋白質(zhì)分析儀測定核酸濃度(ng/μL)并記錄OD。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR定量檢測。

本次實(shí)驗(yàn)是選GAPDH作為內(nèi)參，目的基因引物序列為：GAPDH, forward primer(F): 5’-ACCCCAGCAAGGACACTGAGCAAG-3’, reverse primer (R):5’-GGCCCCTCCTGTTATTATGGGGGT-3’;GRP78[13],F:5’-AAGGGGAGCGTCTGATT GGCGA-3’,R:5’-ATGAGGCGCTTGGCGTCGAAGA-3’;CHOP[13],F:5’-AAATCGAGCGCCTGACCAGG GA-3’, R: 5’-TTGGCACTGGCGTGATGGTGCT-3’.

本次實(shí)驗(yàn)使用Bio-RadCFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR循環(huán)檢測。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，30 s；變性95℃，30 s；退火溫度60℃，30 s；40個(gè)循環(huán)。監(jiān)測熒光信號,獲得相應(yīng)Ct值。采用ΔCt法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲取相對定量值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.3.6 超敏 C 反應(yīng)蛋白檢測

按照超敏C反應(yīng)蛋白試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA(enzyme linked immuno sorbent assay, ELISA)檢測CRP的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 腦梗死面積比分析：

TTC染色如圖2所示。在急性腦梗死12 h，模型組梗死面積與假手術(shù)組相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；紅花注射液組與模型組相比，梗死面積明顯減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。紅花注射液12 h組與依達(dá)拉奉12 h組相比，梗死面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。說明紅花注射液能夠減輕急性腦梗死的梗死面積,對腦起到保護(hù)和修復(fù)作用。(如圖3A)

2.2 大鼠神經(jīng)功能損傷評分分析：

由圖可知，在造模后12 h，模型組神經(jīng)功能缺損與假手術(shù)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在腦卒中12 h，紅花注射液組與模型中相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他組均無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。假手術(shù)組沒有發(fā)生腦梗死，其神經(jīng)損傷評分較低;模型組的神經(jīng)損傷評分高于其他三組，這表明模型組的神經(jīng)功能損傷最嚴(yán)重；紅花注射液的神經(jīng)損傷評分低于模型組，同時(shí)依達(dá)拉奉注射液的神經(jīng)損傷評分也低于模型。(如圖3B)

圖2 大鼠腦TTC染色Figure 2 Gross view of rat brain lisions in the different groups(TTC staining)

注：A 腦梗死面積， B 神經(jīng)功能損傷評分。與模型組相比，# P<0.05。圖3 藥效指標(biāo)Note.A： Area of cerebral infarction.B：Neurological impairment Score. Compared with the model group group, #P<0.05.Figure 3 Comparison of the pharmacodynamic indexes of the different rat groups

2.3 從免疫組織化學(xué)方面分析紅花注射液對腦卒中大鼠的影響

2.3.1 GRP78的表達(dá)：

GRP78陽性染色細(xì)胞呈棕黃色，染色區(qū)域?yàn)榘麧{，多數(shù)細(xì)胞形態(tài)正常，且相對飽滿，其主要形狀為圓形或橢圓形(如圖4)。關(guān)于GRP78的表達(dá)，假手術(shù)組呈強(qiáng)陽性表達(dá)，模型組弱陽性表達(dá)，紅花注射液12 h組弱陽性表達(dá)，依達(dá)拉奉12 h組中度陽性表達(dá)。

圖4 免疫組化GRP78染色圖像 CA1區(qū)(×400)Figure 4 Expression of GRP78 in the rat cerebral CA1 areas (immunohistochemical staining)

2.3.2 CHOP的表達(dá)：

CHOP陽性染色細(xì)胞胞漿淡染呈棕黃色，細(xì)胞核呈棕色，細(xì)胞核大多發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，胞核皺縮，其主要形狀為梭形或條索狀(如圖5)。關(guān)于CHOP的表達(dá)，假手術(shù)組呈中度陽性表達(dá)，模型組弱陽性表達(dá)，紅花注射液12 h組弱陽性表達(dá)，依達(dá)拉奉12 h組中度陽性表達(dá)。

2.4 從RT-qPCR法分析紅花注射液對急性腦梗死大鼠腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子 GRP78、CHOP的mRNA表達(dá)的影響

2.4.1 GRP78 mRNA的表達(dá)：

相較于假手術(shù)組，在腦缺血后12 h模型組GRP78 mRNA相對表達(dá)量升高，P>0.05,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；紅花注射液組GRP78 mRNA在12 h相對表達(dá)量不明顯，P>0.05,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；依達(dá)拉奉注射液組GRP78 mRNA在12 h相對表達(dá)量下降，P>0.05,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，無顯著性差異。與模型組比較，在腦缺血再灌注后12 h，紅花注射液組GRP78 mRNA在12 h相對表達(dá)量無明顯變化，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；依達(dá)拉奉注射液組GRP78 mRNA在12 h相對表達(dá)量下降，P>0.05,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(如圖6 A)。

2.4.2 CHOP mRNA的表達(dá)

相較于假手術(shù)組，在急性腦梗死后12 h，模型組CHOP mRNA相對表達(dá)量升高，P>0.05,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；紅花注射液組CHOP mRNA相對表達(dá)量不明顯，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；依達(dá)拉奉注射液組CHOP mRNA相對表達(dá)量升高，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相較于模型組，在急性腦梗死后12 h，紅花注射液組CHOP mRNA相對表達(dá)量升高，但上升無明顯變化，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；依達(dá)拉奉注射液組CHOP mRNA相對表達(dá)量升高，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(如圖6B)

圖5 免疫組化CHOP染色圖像(×400)Figure 5 Expression of CHOP in the rat cerebral tissues(immunohistochemical staining)

圖6A GRP78 mRNA的表達(dá)Figure 6A Expression of GRP78 mRNA in the brain tissues

2.5 紅花注射液對急性腦梗死大鼠過敏C反應(yīng)蛋白的影響

由圖可以看出，與假手術(shù)組比較，在急性腦梗死后12 h，模型組CRP水平升高，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；紅花注射液組與依達(dá)拉奉組CRP水平無明顯變化，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比較，在腦卒中12 h，紅花注射液組CRP含量明顯低于模型組，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與依達(dá)拉奉注射液組相比較，在腦卒中12 h，紅花注射液組CRP水平無明顯變化，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腦卒中后12 h，紅花注射液組、依達(dá)拉奉注射液組均無顯著性差異(如圖7)。

3 討論

紅花注射液可從改善血流動力學(xué)、改善能量代謝、抑制細(xì)胞凋亡、抗炎癥損傷、調(diào)控基因表達(dá)、改變一氧化氮和內(nèi)皮素含量、抗氧化應(yīng)激、改變血清白細(xì)胞介素含量等方面來發(fā)揮抗腦血管損傷的作用[14]。紅花注射液的主要成分羥基紅花黃素A可有效改善腦缺血再灌注損傷[15]。羥基紅花黃素A能夠通過抑制細(xì)胞凋亡和抑制炎癥相關(guān)信號通路進(jìn)而起到保護(hù)腦細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的作用[15-16]。本實(shí)驗(yàn)基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)炎性反應(yīng)進(jìn)一步研究紅花注射液治療急性腦梗死的作用機(jī)制。

圖6B CHOPmRNA的表達(dá)Figure 6B The expression of CHOP mRNA in the rat brain tissues

注： 與假手術(shù)組相比，#P<0.05。圖7 CRP的表達(dá)Note. Compared with the sham group，#P<0.05。Figure 7 The expression of CRP in the rat brain tissues

ERS是繼細(xì)胞死亡受體通路、線粒體通路后的第三大細(xì)胞凋亡通路，主要由氧化應(yīng)激、鈣失衡及炎癥反應(yīng)等引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的失衡引起的應(yīng)激反應(yīng)。ERS在缺血再灌注損傷中可能具有非常重要的地位[17]。CHOP與GRP78是ERS中的兩個(gè)關(guān)鍵因子。GRP78是熱休克蛋白70家族的一名重要成員，在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。當(dāng)各種原因引起的組織細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境改變，如缺血缺氧，氧化應(yīng)激，病毒細(xì)菌感染，蛋白質(zhì)修飾障礙等時(shí)，GRP78 與蛋白激酶RNA 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(RNA dependent protein kinase like-ER kinase，PERK)、活化轉(zhuǎn)錄因子6 (activating transcription factor 6，ATF6)、肌醇需求酶-1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)解離，促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊，保護(hù)細(xì)胞。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能由于長時(shí)間的缺血而出現(xiàn)功能障礙時(shí)，GRP78表達(dá)開始下降，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)遭到破壞，細(xì)胞凋亡通路被啟動，導(dǎo)致缺血細(xì)胞死亡[18]。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中特異的轉(zhuǎn)錄因子[19]，在非應(yīng)激狀態(tài)下，它的表達(dá)量很低，而在ERS中，其表達(dá)量則大大增加。在本實(shí)驗(yàn)中，使用紅花注射液與依達(dá)拉奉做類比，驗(yàn)證紅花注射液在治療缺血性腦卒中上有顯著作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅花注射液能夠起到促進(jìn)GRP78的表達(dá)和抑制CHOP表達(dá)的作用，它們是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵指標(biāo)，故推測紅花注射液治療急性腦梗死是可調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院仇健等研究表明，與正常組相比，成功模型在缺血2 h 引起GRP78及CHOP表達(dá)升高，且GRP78和CHOP 的升高點(diǎn)不完全重合，在缺血相同時(shí)間內(nèi)再灌注不同時(shí)間GRP78 和CHOP 升高不一致[18]。

CRP是機(jī)體受到微生物入侵或組織損傷等炎癥性刺激時(shí)肝細(xì)胞合成的急性相蛋白, CRP也屬于炎性因子之一[20]。CRP升高的程度反應(yīng)炎癥組織的大小或活動性，在急性炎癥和感染時(shí)，CRP與疾病活動性有良好的相關(guān)性。研究證明在腦卒中首發(fā)時(shí)，CRP的含量會明顯上升[21]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紅花注射液組的CRP明顯低于模型組，進(jìn)而可以說明紅花注射液對于炎癥有一定的抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷的本質(zhì)是炎癥反應(yīng)[22]。該實(shí)驗(yàn)中紅花注射液使CRP表達(dá)下降，也印證了紅花注射液對于急性腦梗死具有良好的治療作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，紅花注射組GRP78 mRNA，CHOP mRNA的表達(dá)與模型組比較均無顯著性差異，推測可能與本實(shí)驗(yàn)選取的檢測時(shí)間點(diǎn)有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)僅檢測腦缺血再灌注后12 h而未檢測24 h的GRP78、CHOP基因表達(dá)情況，后續(xù)研究將進(jìn)一步檢測其他時(shí)間點(diǎn)及預(yù)用藥干預(yù)時(shí)的GRP78 mRNA，CHOP mRNA表達(dá)情況，以充實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由于紅花注射液能夠影響ERS中的關(guān)鍵指標(biāo)，推測CRP可能與ERS中某條通路調(diào)控的炎癥因子有直接或間接的關(guān)系，也有待進(jìn)一步研究，使紅花注射液治療急性腦梗死的機(jī)制更加清晰明確，進(jìn)而為臨床使用紅花注射液提供更強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)。