臧新山，申賢坤，裴文鋒，吳嫚，李興麗，張金發(fā)，于霽雯

（棉花生物學(xué)國家重點實驗室/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/農(nóng)業(yè)部棉花生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，河南安陽455000）

棉花是重要的經(jīng)濟、油料作物。由于我國不是棉花原產(chǎn)地，因此在棉花育種上所選擇的親本材料大部分都是從國外引種而來[1]。雖然經(jīng)過科研人員不斷的努力，在棉花新品種選育方面取得了一定的成就，但是我國棉花遺傳基礎(chǔ)狹窄，遺傳資源日益枯竭，導(dǎo)致近幾年來我國在新育成棉花品種的豐產(chǎn)性以及品質(zhì)方面很難有大的突破[2]。

利用自然突變和物理化學(xué)誘變獲得變異材料是作物育種的基礎(chǔ)[3]。突變體也是研究植物遺傳調(diào)控、基因定位、分子克隆、基因表達(dá)分析與功能鑒定的良好材料[4]。突變可以分為自然狀態(tài)下發(fā)生的自發(fā)突變，以及人工誘導(dǎo)下發(fā)生的誘發(fā)突變[5]。自發(fā)突變是自然狀態(tài)下發(fā)生的突變，是隨機的、不定向的，但因自然界中生物的性狀普遍是比較穩(wěn)定的，所以突變頻率一般較低，很難進行比較系統(tǒng)的鑒定和收集。誘發(fā)突變是人工利用物理和化學(xué)因素誘導(dǎo)植物遺傳變異，并對其后代突變體進行篩選、鑒定和研究的一種技術(shù)，具有提高突變頻率、擴大突變譜和促進基因重組的特點，可以在改變單一性狀，創(chuàng)造作物新材料方面發(fā)揮重要作用[6]。

化學(xué)誘變劑大部分是一些分子結(jié)構(gòu)不太穩(wěn)定的化合物，主要誘導(dǎo)堿基改變，如堿基置換、移碼突變等，而染色體水平上的變異則較少。常用的化學(xué)誘變劑種類通常有烷化劑、堿基類似物、抗生素、疊氮化物、亞硝酸和羥胺等，棉花誘變育種中經(jīng)常用到的化學(xué)誘變劑主要有甲基磺酸乙酯（Ethyl methyl sulfonate，EMS）、疊氮化鈉等[7]。

EMS是1種最為有效且應(yīng)用較多的化學(xué)誘變劑，屬于烷化試劑，已被廣泛應(yīng)用在作物育種。EMS誘變的變異體后代基因分離較少、穩(wěn)定性好，產(chǎn)生的突變類型豐富，被廣泛應(yīng)用于植物突變體庫的構(gòu)建、種質(zhì)資源創(chuàng)制等研究中[8]。EMS誘變作為1種有效的育種輔助技術(shù)，可以改善棉花的重要農(nóng)藝性狀。研究者利用EMS溶液處理棉花種子，獲得產(chǎn)量和纖維品質(zhì)性狀都有提高的3個棉花突變品系，認(rèn)為EMS誘變可以創(chuàng)建有益的突變材料，打破基本產(chǎn)量構(gòu)成與纖維品質(zhì)之間負(fù)相關(guān)的關(guān)系[9]。Bechere等[10]用濃度為3.2%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的EMS溶液處理棉花種子2 h，獲得纖維品質(zhì)突變體。Patel等[11]利用EMS誘變棉花，獲得3 164個M5突變系，篩選到157個纖維品質(zhì)優(yōu)良的突變系。Bechere[12]利用濃度為2.45%的EMS溶液處理棉花種子2 h，選育出1個僅有少量短纖維的突變體，具有軋棉速度快且耗能少的優(yōu)點[12]。研究者利用化學(xué)誘變技術(shù)來提高油脂含量和改變油脂成分，并獲得了棉花油脂突變體[13]。

在前期預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，本研究利用1.0%濃度的EMS對棉花種子進行化學(xué)誘變處理，以發(fā)芽率和生長勢為指標(biāo)，篩選出最佳處理時間，為大規(guī)模EMS誘變奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用遺傳性穩(wěn)定的亞洲棉標(biāo)準(zhǔn)系石系亞1號和陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系品種TM-1為材料，由國家棉花種質(zhì)中期庫杜雄明研究員提供。石系亞1號為未脫絨的種子；TM-1種子經(jīng)硫酸脫絨，蒸餾水沖洗干凈后，晾干后備用。

EMS誘變劑購自索萊寶公司（北京）。

1.2 EMS誘變處理

種子粒選后，在28℃搖床中以蒸餾水浸種24 h。用吸水紙吸去表面水分，浸入10 mmol·L－1（pH 7.0）的磷酸鹽緩沖液稀釋的1%EMS誘變液中，未脫絨的石系亞1號材料種子進行4 h、5 h、6 h和7 h的誘變處理，脫絨的TM-1材料種子進行5 h、6 h、7 h和8 h的誘變處理，每個時間點處理100粒種子，未設(shè)置重復(fù)。誘變劑與種子的比例為：1 mL誘變劑對應(yīng)1粒種子，對照浸入到10 mmol·L－1（pH 7.0）的磷酸鹽緩沖液中，方法和時間同處理。處理后用自來水沖洗5～10次，以去除殘留的EMS。

1.3 溫室及田間發(fā)芽率

將處理過的種子直接播種于營養(yǎng)土中，并種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所植物培養(yǎng)溫室中（28℃，光照12 h/黑暗12 h），統(tǒng)計發(fā)芽率和觀察生長勢。

在篩選到最佳處理時間后，進一步設(shè)置3次重復(fù)對石系亞1號和TM-1種子分別進行6 h和8 h的EMS誘變，每個重復(fù)100粒種子。大規(guī)模田間誘變材料種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所的田間試驗農(nóng)場（河南省安陽縣）。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS誘變預(yù)處理

在28℃搖床中以蒸餾水浸種24 h，用1%濃度EMS處理未脫絨的石系亞1號和脫絨的TM-1種子。然后將種子播種于營養(yǎng)土中，從第2天開始統(tǒng)計出苗率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照（CK）相比，EMS處理的石系亞1號和TM-1種子發(fā)芽時間延遲、發(fā)芽率明顯降低、出苗不整齊（圖1、圖2）。對照條件下，石系亞1號和TM-1種子在播種后2 d左右即可見發(fā)芽，而經(jīng)1.0%EMS誘變處理后，播種后2 d未見發(fā)芽，3 d后才可見發(fā)芽植株，發(fā)芽開始時間約晚1 d。從播種后第2天到第10天的調(diào)查過程中，除TM-1處理5 h結(jié)果外，其他誘變處理后的發(fā)芽率都低于對照條件下的發(fā)芽率。

圖1 EMS處理不同時間下石系亞1號和TM-1種子的發(fā)芽率

圖2 TM-1種子種植5天后的出苗情況

播種10天后，石系亞1號種子對照組發(fā)芽率為89%，1.0%EMS誘變處理4 h、5 h、6 h和7 h的發(fā)芽率分別為57%、56.4%、38.1%和28%；；TM-1種子對照組發(fā)芽率為69.7%，1.0%EMS誘變處理5 h、6 h、7 h和8 h的發(fā)芽率分別為71%、43.3%、55.1%和31.1%。因此，推測在EMS溶液濃度為1.0%條件下，石系亞1號和TM-1材料的最佳誘變時間分別為6 h和8 h（圖1）。

2.2 EMS誘變劑量確認(rèn)

為了進一步確認(rèn)EMS誘變劑量，在EMS濃度為1.0%條件下，石系亞1號材料種子處理6 h，TM-1材料種子處理8 h為各自的最佳誘變時間。進一步設(shè)置3次重復(fù)進行EMS誘變。在CK條件下，石系亞1號和TM-1的發(fā)芽率分別為87.3%和70.0%；在1.0%EMS誘變處理條件下，石系亞1號和TM-1的發(fā)芽率分別為39.3%和32.0%（圖3）。該結(jié)果進一步確認(rèn)，1.0%EMS溶液濃度條件下，石系亞1號和TM-1材料的最佳誘變時間分別為6 h和8 h。

圖3 石系亞1號和TM-1種子EMS處理后發(fā)芽率

2.3 EMS誘變對田間生長情況的影響

EMS誘變處理后，溫室田間下，石系亞1號和TM-1的發(fā)芽率分別為39.3%和32.0%；而大田中，石系亞1號和TM-1的發(fā)芽率分別為21.3%和16.9%。大田中，EMS誘變發(fā)芽率較對照明顯降低，低于在溫室條件下的發(fā)芽率（圖3、表1）。并且發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽的植株出現(xiàn)一定的畸變株，主要包括不育、早衰和葉片卷曲。

表1 石系亞1號和TM-1發(fā)芽率和畸變率統(tǒng)計 %

3 討論與結(jié)論

化學(xué)誘變育種在植物品種改良上具有獨特的作用：一方面，EMS誘變能夠產(chǎn)生具有有利變異的新種質(zhì)資源，為植物誘變育種提供材料；另一方面，EMS誘變的不確定性為獲得重要農(nóng)藝性狀的功能基因提供可能性，對加快植物育種進程和功能基因組學(xué)研究都具有重要的意義。

本實驗通過對亞洲棉二倍體標(biāo)準(zhǔn)系石系亞1號和陸地棉四倍體標(biāo)準(zhǔn)系TM-1的種子進行1.0%EMS誘變處理，設(shè)置不同處理時間梯度，篩選出半致死處理時間（即發(fā)芽率為對照的40%～60%、后期生長明顯緩慢的處理時間）。結(jié)果標(biāo)明，石系亞1號材料種子在1.0%EMS溶液中處理6 h為最佳誘變時間，TM-1材料種子在EMS溶液濃度為1.0%條件下處理8 h為最佳誘變時間，該研究結(jié)果為進一步研究誘變后成活植株的性狀奠定基礎(chǔ)。

利用EMS誘變產(chǎn)生棉花突變體，之前已有文獻報道。例如孔德培等[14]研究表明，利用0.6%EMS溶液（體積分?jǐn)?shù)），28℃處理8 h，種子發(fā)芽率為51%，作者認(rèn)為該處理組合誘變效果最佳；葉春秀等[15]研究表明，1.0%EMS溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）處理新疆早熟陸地棉材料223種子2 h效果最佳；Bechere等[10,12]用濃度為3.2%和2.45%的EMS溶液（體積分?jǐn)?shù)）處理棉花種子2 h，篩選陸地棉突變體。結(jié)合這些研究報道，本文作者提出利用1.0 %EMS溶液（體積分?jǐn)?shù)）進行EMS誘變是可行的；經(jīng)過時間梯度篩選，石系亞1號和TM-1種子的最佳誘變時間分別為6 h和8 h。

大田條件較溫室復(fù)雜，受種植深度和半干旱等影響，兩個材料在大田中的發(fā)芽率僅相當(dāng)于對照的約25%。因此，在大田中進行EMS誘變處理，根據(jù)實際情況調(diào)節(jié)單位面積的播種量。