周麗容，譚新

（新疆阿拉爾市十六團(tuán)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，新疆阿拉爾843018）

棉花是世界上主要的天然纖維作物。中國是世界棉花的主產(chǎn)區(qū)，新疆是中國最大的棉花種植區(qū)[1]。盡管棉花是鹽堿地的先鋒作物，新疆土壤次生鹽堿化仍然嚴(yán)重制約棉花生產(chǎn)，影響中國棉花生產(chǎn)安全。盡管科學(xué)家投入了大量的工作研究棉花耐鹽機(jī)理、選育耐鹽棉花品種，但對于棉花鹽脅迫的調(diào)控機(jī)理尚不清晰。前人研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中位于質(zhì)膜上的鈉氫交換蛋白NHX7/SOS1（Sodium/hydrogen exchanger 7//salt overly sensitive 1）參與Na＋/H＋轉(zhuǎn)運(yùn)，維持胞內(nèi)Na＋和K＋穩(wěn)態(tài)，是響應(yīng)鹽脅迫響應(yīng)的必需基因[2]。SOS1蛋白通過與一系列蛋白SOS2、SOS3等組成SOS（Salt-overly-sensitive SOS）信號途徑來維持離子穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)鹽脅迫響應(yīng)[2-5]。擬南芥AtNHX7/SOS1基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有23個外顯子和22個內(nèi)含子，編碼區(qū)序列長度為3 438 bp，編碼包含1 146個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。該蛋白分子量為127 kD，其N端高度疏水，C端高度親水，包含12個跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域[6]。目前，尚未在陸地棉中鑒定并分析GhNHX7基因。棉花基因組序列的測定與發(fā)表[7-10]為我們挖掘鹽脅迫響應(yīng)基因、分析相關(guān)基因功能提供了資源。我們通過在陸地棉基因組中掃描獲得了2個GhNHX7基因。通過基因、蛋白及啟動子序列分析，了解該基因的特征。對鹽脅迫下GhNHX7基因的表達(dá)進(jìn)行分析，表明該基因參與鹽脅迫的響應(yīng)。本研究為進(jìn)一步探討GhNHX7基因在棉花鹽脅迫響應(yīng)中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 GhNHX7基因鑒定及啟動子序列獲取和基因結(jié)構(gòu)分析

在UNIPROT（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫中檢索并下載擬南芥AtNHX7/SOS1基因。用AtNHX7/SOS1（ID：Q9LKW9）序列作為探針，通過同源性搜索BLASTP軟件檢索陸地棉基因組（Gossypium hirsutumGenome NAU-NBI Assembly v1.1 &Annotation v1.1，https://www.cottongen.org/node/2068581）蛋白注釋文件[11]。在棉花基因組中提取GhNHX7基因起始密碼子ATG上游2 000 bp（base pair，堿基對）序列作為該基因的啟動子。根據(jù)基因序列和CDS序列，利用Gene Structure Display Server（GSDS）2.0[12]（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）軟件展示GhNHX7基因結(jié)構(gòu)。利用MCScanX[13]軟件分析GhNHX7基因的復(fù)制類型。

1.2 GhNHX7蛋白結(jié)構(gòu)域、保守基序分析

用Pfam數(shù)據(jù)庫和NCBI CD search tool檢索GhNHX7蛋白保守結(jié)構(gòu)域；用MEME（http://memesuite.org/）數(shù)據(jù)庫檢索GhNHX7蛋白中的基序，識別數(shù)設(shè)置為10。

1.3 GhNHX7基因啟動子中順式作用元件分析

利用植物啟動子序列順式作用元件識別數(shù)據(jù)庫PLACE[14]（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）檢 索AtNHX7/SOS1，GhNHX7a和GhNHX7b的啟動子序列中的順式作用元件。

1.4 GhNHX7基因表達(dá)分析

GhNHX7基因表達(dá)數(shù)據(jù)來自于NCBI數(shù)據(jù)庫中Gossypium hirsutumTM-1的RNA測序數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，登陸號為PRJNA248163（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA248163）。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhNHX7基因鑒定

通過同源性檢索，在陸地棉基因組中鑒定出與擬南芥AtNHX7/SOS1相似性最高的2個基因Gh_A03G0996（相似度63%），Gh_D02G1385（相似度63%），分別命名為GhNHX7a和GhNHX7b（表1）。GhNHX7a和GhNHX7b分別位于A03和D02的染色體的中部區(qū)域。通過MCScanX分析發(fā)現(xiàn)，GhNHX7a和GhNHX7b基因隨著全基因組/片段復(fù)制事件的發(fā)生而擴(kuò)增。GhNHX7a和GhNHX7b分別包含22個和21個外顯子，與AtNHX7/SOS1外顯子數(shù)目相近。GhNHX7a和GhNHX7b基因的編碼區(qū)序列長度分別為3 549 bp和3 555 bp，GC含量均為41%。GhNHX7a和GhNHX7b分別編碼包含1 182和1 184個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，分子量分別為131.437 kD和132.242 kD。

表1 GhNHX7基因鑒定及特征

2.2 GhNHX7基因結(jié)構(gòu)特征

利用GSDS 2.0軟件可視化AtNHX7、GhNHX7a和GhNHX7b基因結(jié)構(gòu)（圖1）。GhNHX7a和GhNHX7b分別包含有22和21外顯子，21個和20個內(nèi)含子。GhNHX7a和GhNHX7b與AtNHX7的外顯子特征較為相似，但內(nèi)含子長度差異較大，可見其基因的長度差異是內(nèi)含子區(qū)序列擴(kuò)張引起的。

2.3 GhNHX7蛋白結(jié)構(gòu)特征

如圖2所示，通過在Pfam數(shù)據(jù)庫中檢索發(fā)現(xiàn)GhNHX7a/b基因都具有鈉氫交換區(qū)（Na_H_exchanger）結(jié)構(gòu)域（PF00999）。這個結(jié)構(gòu)域在N端具有10～12個跨膜結(jié)構(gòu)，在C端具有1個大的胞質(zhì)區(qū)（親水區(qū)）。第3～12跨膜區(qū)相比其他Na_H_Exchanger家族成員較為一致。其中第6和第7跨膜區(qū)高度保守，被認(rèn)為是轉(zhuǎn)運(yùn)Na＋和H＋的區(qū)域。在NCBI CD-search Tool中檢索發(fā)現(xiàn)GhNHX7a、GhNHX7b和AtNHX7/SOS1基因除了具有PF00999結(jié)構(gòu)域外，還具有環(huán)化核苷酸結(jié)合區(qū)（Cyclic nucleotide-binding，cNMP-binding）結(jié)構(gòu)域（PF00027）。

圖1 AtNHX7、GhNHX7a和GhNHX7b基因結(jié)構(gòu)

圖2 AtNHX7、GhNHX7a和GhNHX7b蛋白特征

2.4 GhNHX7基因啟動子區(qū)順式作用調(diào)控元件分析

利用植物啟動子序列順式作用元件識別數(shù)據(jù)庫PLACE檢 索AtNHX7/SOS1，GhNHX7a和GhNHX7b的啟動子序列的順式作用元件。如表2所示，AtNHX7/SOS1，GhNHX7a和GhNHX7b的啟動子序列具有較多相同的高度富集順式作用元件，其中MYC、ARR1-binding element和Dof是重要的脅迫響應(yīng)元件。推測GhNHX7a和GhNHX7b參與了陸地棉脅迫響應(yīng)進(jìn)程。

表2 GhNHX7基因啟動子區(qū)順式作用調(diào)控元件類型及數(shù)目

2.5 GhNHX7a/b基因在鹽脅迫后和不同組織的表達(dá)分析

為了解GhNHX7a/b在棉花生長發(fā)育和響應(yīng)鹽脅迫中的潛在功能，我們研究了GhNHX7a/b鹽脅迫的葉片中和在生長發(fā)育過程不同棉花組織中的表達(dá)量。與0 h相比，鹽脅迫后1 h、3 hGhNHXT7a在棉花葉片中表達(dá)量無變化；在鹽脅迫處理后6 h和12 h表達(dá)量提高（圖3A），即GhNHX7在處理中期（處理后6～12 h）參與了鹽脅迫響應(yīng)調(diào)控。由圖3B可以看出，GhNHX7a/b基因在萼片、葉、花、雌蕊、根、雄蕊、莖和花托中的均表達(dá)；GhNHX7a基因在莖中的表達(dá)量最高，GhNHX7b基因在各個組織中的表達(dá)差異不大。

3 討論與結(jié)論

隨著我國棉產(chǎn)區(qū)西進(jìn)東移戰(zhàn)略的進(jìn)行，新疆成為我國棉花主產(chǎn)區(qū)，但新疆地區(qū)土壤鹽漬化嚴(yán)重[15]。因此，通過基因工程提高棉花鹽脅迫抗性、選育耐鹽品種對保障棉花生產(chǎn)安全非常重要。因棉花基因組的復(fù)雜性，研究陸地棉鹽脅迫響應(yīng)機(jī)理，挖掘耐鹽基因較為困難。采用同源性檢索等生物信息分析的方法，在棉花基因組中查找其他物種中已經(jīng)明確的鹽脅迫響應(yīng)基因，是1種較為快速的探索棉花耐鹽機(jī)理的方法。

圖3 GhNHX7a和GhNHX7b基因在鹽脅迫下及不同組織中的表達(dá)

擬南芥的SOS（salt-overly-sensitive）信號網(wǎng)絡(luò)，是第一個發(fā)現(xiàn)的非生物脅迫響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)[16]。在前人不斷的研究探索下[2-5,17-19]，SOS信號網(wǎng)絡(luò)被證實并完善。這個信號網(wǎng)絡(luò)主要包括3個重要的組分：SOS1，SOS2，SOS3。其中SOS1是定位于質(zhì)膜上的Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的Na＋含量，受到SOS2和SOS3基因的調(diào)控。擬南芥的AtNHX7基因在根、莖和葉中均表達(dá)，且在根中表達(dá)水平比莖中高[20]。在本研究中，通過同源性檢索的方法，在陸地棉基因組中檢索到了2個GhNHX7基因，分別命名為GhNHX7a和GhNHX7b。這2個基因具有與SOS1基因相似的結(jié)構(gòu)，分別具有22和21個外顯子。同時發(fā)現(xiàn)GhNHX7a/b蛋白具有與SOS1同樣的Na_H_Exchanger和cNMP_binding結(jié)構(gòu)域。保守基序分析發(fā)現(xiàn)，SOS1和GhNHX7a/b的保守基序一致。GhNHX7a/b的生物信息分析表明其可能具有與SOS1基因相同的功能。啟動子區(qū)順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，SOS1和GhNHX7a/b具有大量相同的順式作用元件，例如MYC、ARR1-binding element和Dof是重要的脅迫響應(yīng)元件。推測在陸地棉中，GhNHX7a/b基因是脅迫響應(yīng)基因。基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)GhNHX7a/b基因在鹽脅迫后表達(dá)水平升高，可見其可能參與了棉花鹽脅迫響應(yīng)。該研究為棉花耐鹽基因GhNHX7a/b挖掘與利用提供了依據(jù)，為深入研究陸地棉耐鹽機(jī)理，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行耐鹽棉花的選育提供了資源。