劉玉玲，王聰，劉鵬飛，王元昌，劉方，彭仁海*

（1.安陽工學院，河南 安陽455000；2.中國農業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南 安陽455000）

在植物雜交育種特別是遠緣雜交中，可以通過對基因組中染色體或染色體片段來源的識別，分析雜交后代的遺傳組成。在起源進化研究中，研究策略之一就是借助基因組間的相似性、染色體間的共線性等對它們的親緣關系進行推測。熒光原位雜交技術（Flourescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）能夠根據(jù)染色體的特異細胞遺傳學標記，直觀反映基因組間的相似性、染色體間的共線性，在不同物種研究中被廣泛應用。其中，以基因組DNA為探針，在靶標基因組染色體上進行原位雜交的基因組原位雜交技術（Genomicin situhybridization，GISH）以及以大片段的BAC（Bacterial artificial chromosome）克隆為探針的BAC-FISH是檢測不同來源的染色體組、染色體片段的1種高效方法。在檢測外源染色體或染色體片段、研究基因組結構及其空間排布、物種的起源與進化等領域廣泛應用[1-3]。

熒光原位雜交技術應用過程中1個重要的阻礙就是基因組重復序列的影響，高含量的重復序列增加了雜交過程中的背景信號。在雜交過程中，封阻DNA基于堿基互補配對原則與基因組重復序列雜交，阻止探針DNA與非特異性位點或非目標DNA雜交，可以降低背景信號，提高熒光原位雜交效率[4-5]。

基因組序列分析表明，棉花基因組重復序列含量高達60%～80%[6-8]，在熒光原位雜交中封阻DNA的應用至關重要。研究表明，經(jīng)過處理的、長度在200～800 bp基因組DNA片段對非特異性位點的封阻最有效，對基因雜交最有利[9-10]。

目前，封阻DNA制備方法主要有煮沸法、超聲波打斷法、利用注射針頭抽打打斷等[4-5]。用超聲波打斷法影響因素較多，如超聲樣品的體積、超聲探頭在樣品中深度、超聲環(huán)境溫度、超聲波處理時間、超聲功率和實驗操作等都會對結果產生影響[11]。注射針頭抽打打斷法操作簡單，不依賴其它儀器，但是人為操作注射器力度無法精確控制，所以實驗數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性較差。在其它物種中煮沸法和超聲波打斷法最為常用，但是受基因組DNA含量與堿基組成的影響，不同物種的處理參數(shù)會存在差異[5]。本研究以陸地棉為材料，通過不同處理方法、處理條件設置，探討棉花基因組封阻DNA制備方法。以期為棉花熒光原位雜交的應用提供簡單易行的封阻DNA制備手段。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為陸地棉TM-1（四倍體）的嫩葉。FISH驗證使用的BAC克隆299N22來源于海島棉基因組BAC文庫。

1.2 方法

1.2.1棉花基因組DNA的提取。選取實驗田棉花新長出的葉片約10 g，液氮中研磨30～40 min，磨碎的粉末放入預先冷凍的50 mL離心管中。采用宋國立等[12]改良的CTAB法進行DNA提取。提取的DNA通過1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000進行完整度和濃度檢測。

1.2.2煮沸法制備封阻DNA。分別取50μL TM-1基因組DNA置于1.5 mL的離心管中，封口膜密封，固定在浮板上，然后置于沸水中，分別煮沸10 min、15 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min。煮沸后取出置于冰上。待全部結束，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段大小。

1.2.3超聲波打斷法制備封阻DNA。預實驗：超聲波處理參數(shù)較多，首先進行固定超聲波參數(shù)、調整總超聲波處理時間實驗。850μL的TM-1基因組DNA置于2 mL離心管，固定在浮板上置于冰水混合物中，注意探頭不能碰到管底。參數(shù)設置：每個循環(huán)中超聲處理5 s、間隔時間20 s、功率15%。超聲波處理總時間分別為15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min。每次從離心管中取出5μL，保存于冰盒中。待全部結束，用2%瓊脂糖凝膠電泳對片段大小進行檢測。

在預實驗的基礎上，調整處理參數(shù)與處理時間。取200μLTM-1基因組DNA置于500μL EP管。固定在浮板上，置于含有冰水混合物的200 mL燒杯中，放于超聲波破碎儀，調整探頭在樣品中的位置進行處理。超聲波處理參數(shù)也作了適當調整，即固定總超聲波處理時間10 min、處理間隔時間20 s、超聲功率25%的基礎上，調整單次超聲時間，分別設置為每循環(huán)中超聲時間10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s。每隔5 min拿出樣品用渦旋震蕩儀震蕩3 s，使樣品充分混合，完成一次設定的實驗參數(shù)，即從管中取出5μL，保存于冰盒中。待處理全部結束，用2%瓊脂糖凝膠電泳對片段大小進行檢測。

1.3 熒光原位雜交

染色體制片、DNA探針制備、FISH參照之前的操作程序進行[13]。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA檢測

對CATB法提取的陸地棉TM-1基因組DNA通過Nanodrop 2000進行了濃度與質量檢測，2個重復的樣品濃度分別為1 540 mg·L－1和2 424 mg·L－1，A260/280值分別為2.00和1.92，符合要求。使用瓊脂糖凝膠電泳進行完整度檢測（圖1）。DNA條帶完整，略有拖尾現(xiàn)象，可能是提取過程造成DNA的輕微降解，但綜合上述檢測結果，可以滿足后續(xù)實驗要求。分別對2個重復的DNA樣品進行稀釋，濃度800～900 mg·L－1，－20℃存放備用。

2.2 煮沸法制備封阻DNA

通過瓊脂糖凝膠檢測沸水浴處理10min、15min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min的DNA打斷效果，結果表明（圖2），沸水浴10 min，DNA樣品出現(xiàn)彌散條帶，說明DNA已經(jīng)被打斷，沸水浴10 min和15 min的DNA片段長度多數(shù)在1 200 bp以上（圖2）；DNA樣品沸水浴20 min，30 min和40 min，片段大小主要在500 bp以上的較大范圍，并且不同處理時間沒有明顯區(qū)別；DNA樣品沸水浴50 min和60 min時的DNA片段長度主要集中在400～1 200 bp；DNA樣品沸水浴70 min和80 min時，DNA片段主要集中在200～800 bp，其中，80 min處理效果較明顯，條帶集中，可以滿足封阻DNA要求的片段長度；DNA樣品沸水浴90 min時的DNA樣品條帶已經(jīng)明顯下移，片段小于100 bp（圖2）。由此可見，棉花基因組DNA沸水浴80 min處理所得DNA片段適宜作封阻DNA。

圖1 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

圖2 煮沸處理DNA檢測結果

2.3 超聲波處理制備封阻DNA

超聲波預實驗處理結果顯示，在超聲處理5 s、間隔時間20 s、功率15%的條件下，超聲波處理總時間從15 min到240 min，得到的DNA片段與未處理的對照基本上沒有差異，說明預實驗參數(shù)下的超聲波處理對棉花DNA打斷效果不明顯。

調整參數(shù)后，超聲波處理的基因組DNA通過瓊脂糖凝膠檢測結果見圖3。在固定總超聲處理時間10 min、間隔時間20 s、功率25%的條件下，超聲時間為10 s時DNA條帶已經(jīng)出現(xiàn)明顯的彌散，片段大小主要在1 200 bp以上；超聲時間為20 s時，DNA片段大小略有變化；超聲時間為30 s時，DNA片段長度集中在500～2 000 bp；超聲時間為40 s時，DNA片段主要集中于400～1 200 bp左右；超聲時間為60 s時，多數(shù)DNA片段小于400 bp。

圖3 超聲波處理DNA檢測結果

2.4 FISH檢驗封阻DNA效果

299N22是在棉花中發(fā)現(xiàn)的1個富含重復序列的BAC克隆，其中的重復序列元件在四倍體棉種的A亞組含量很高[14]。為了檢驗所制備的封阻DNA在熒光原位雜交中的效果，選用煮沸80 min的陸地棉基因組DNA作封阻，以Dig-Nick Translation Mix標記的BAC-DNA為探針，在陸地棉染色體有絲分裂中期進行熒光原位雜交。雜交混合液分別設置了無封阻DNA和有封阻DNA進行對照。結果顯示，無封阻DNA的BAC-FISH中信號彌散分布，主信號不明顯（圖4a）；沸水浴80 min獲得的封阻DNA的BAC-FISH在彌散信號中出現(xiàn)1對明顯的主信號（圖4b）。

圖4 BAC克隆299N22在陸地棉有絲分裂中期染色體熒光原位雜交結果

3 討論與結論

染色體特異的SSR分子標記NAU1201位于A13和D13染色體[14-16]，BAC克隆299N22是利用標記NAU1201從海島棉基因組BAC文庫篩選出來的[17]，在遺傳連鎖圖中分子標記NAU1201，該BAC克隆片段長度大約為100 kb。由于棉花基因組重復序列含量比較高，使BAC克隆中含有大量目標序列之外的重復元件，導致FISH結果中布滿彌散信號，目標信號被掩蓋；封使用阻DNA可以結合一部分重復序列，使目標信號得以呈現(xiàn)。因此，沸水浴80 min獲得的陸地棉基因組DNA可以作為FISH實驗過程中封阻DNA。

煮沸法主要考慮到樣品體積和與沸水處理時間，處理過程中影響因素較少，所以相對來說，該方法可重復性較高。實驗結果表明：煮沸法制備封阻DNA最適時間為沸水浴80 min。超聲波打斷法處理的理想?yún)?shù)為超聲波處理時間40 s、間隔時間20 s、功率25%，總時間為10 min。但是，超聲波打斷法涉及到多個儀器參數(shù)的設置，主要有超聲處理時間、間隔時間、功率、總超聲時間等，任何一個參數(shù)的改變都會對處理結果產生影響。而且還有操作方面因素的影響，如在處理過程中為了避免溫度變化，需要冰浴的使用，冰的融化會影響到探頭與樣品的接觸面，干擾實驗結果，所以超聲波處理法相比煮沸法而言控制復雜，重復性差，總體處理效果比較，煮沸法要比超聲波打斷法效果好。