陳若詩，吳琪，王志維

主動脈夾層（AD）作為現(xiàn)今高發(fā)的一類大血管疾病，疾病進展迅速、治療措施局限，患者死亡率高。其典型表現(xiàn)為主動脈內(nèi)膜撕裂，血液涌入中膜內(nèi)，且沿中膜長軸剝離，形成真、假血管腔[1]。主動脈夾層發(fā)生的早期病理改變?yōu)橹鲃用}中膜囊性變（AMD），主要表現(xiàn)為平滑肌細胞缺失和凋亡、細胞外基質(zhì)的沉積、彈力纖維的斷裂等。其中，主動脈平滑肌細胞的缺失和凋亡在導(dǎo)致主動脈夾層發(fā)生中有著極其重要的作用[2]。

研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）對調(diào)控細胞凋亡、細胞自噬、氧化應(yīng)激及細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)等具有極其重要的作用，且有研究證實，ERS與多種心血管疾病如心肌肥厚、心肌缺血再灌注損傷等的發(fā)生密切相關(guān)[3]。但是，ERS在主動脈夾層發(fā)生發(fā)展中的作用及其在主動脈平滑肌細胞（VSMCs）凋亡中的聯(lián)系尚無報道。本研究通過分析ERS相關(guān)的環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白（CHOP）和活性轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）在主動脈夾層人體標本和動物標本中的表達情況，研究其與主動脈夾層發(fā)病過程中VSMCs凋亡的相關(guān)性，旨在為主動脈夾層提供新的診療思路。

1 材料與方法

1.1 人體標本與實驗分組選取2017年3月至2018年4月于武漢大學(xué)人民醫(yī)院確診為StanfordⅠ型夾層并行胸主動脈夾層全弓置換患者13例為AD組（n=13），患者均經(jīng)過CTA檢查確診為胸主動脈夾層，三維重建的結(jié)果顯示破口產(chǎn)生于升主動脈。所有患者術(shù)前均無冠心病、外周血管疾病、糖尿病、關(guān)節(jié)炎、膜性腎病。患者均在入院后行急診手術(shù)，我們在術(shù)中取AD患者病變的血管組織。標本取出后，預(yù)冷的生理鹽水漂洗主動脈組織，一部分凍存于液氮中，一部分用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋用于進行后續(xù)檢測。另選取5例于武漢大學(xué)人民醫(yī)院接受心臟移植的患者作為Donor組（此5例患者均無大血管疾病，其在心臟移植術(shù)中取下的心臟主動脈血管可作為相對正常主動脈血管組織）。術(shù)前所有實驗方案均已告知家屬，并簽署知情同意書，且該部分實驗經(jīng)武漢大學(xué)倫理委員會審批同意。

1.2 實驗動物與模型構(gòu)建選用SPF級野生型4周齡SD大鼠20只，實驗動物均由武漢大學(xué)動物實驗中心提供[動物使用許可證號：SYXK（鄂）2015-0027]；飼喂于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物實驗中心。將實驗動物隨機分為AD組（n=10）及Control組（n=10）。AD組飼喂含0.3% β-異氨基丙腈酯（BAPN）的維持飼料進行主動脈夾層動物模型構(gòu)建，Control組飼喂普通維持飼料。動物模型構(gòu)建開始后密切觀察造模大鼠生存狀況，若大鼠于造模過程中死亡，立即解剖，明確死因，并收集主動脈撕裂范圍的主動脈組織標本液氮凍存或4%多聚甲醛固定。4周后各組存活大鼠統(tǒng)一取材（AD組取主動脈撕裂部位，Control組取相應(yīng)部位血管），主動脈標本液氮凍存或4%多聚甲醛固定用于后續(xù)實驗。

1.3 實驗試劑CHOP抗體購自美國Proteintech公司（貨號：15204-1-AP）；ATF4抗體購自美國Proteintech公司（貨號：10835-1-AP）；GAPDH抗體購自美國Proteintech公司（貨號：60008-1-Ig）。抗鼠二抗購自美國Cell Signaling technology公司（貨號：14709S）；抗兔二抗購自美國Cell Signaling technology公司（貨號：5151P）。TUNEL試劑盒購自中國生工（貨號：E607178）；β-氨基丙腈酯（BAPN）購自日本TCI公司（貨號A0796）。Trizol試劑購自美國BBI公司（貨號：B610409）。一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒，購自中國生工公司（貨號：B639277）；SYBR Green購自上海生工（貨號：B110031）。

1.4 TUNEL染色各組標本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后進行切片。將切片置于60℃恒溫烘箱中烤片融蠟1 h，然后置于二甲苯溶液中進一步脫去殘余石蠟，常規(guī)步驟水化，PBS漂洗。蛋白酶K消化修復(fù)切片；將TUNEL試劑盒相關(guān)試劑配置好后，根據(jù)說明書按步驟操作。染色完成后，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精脫色，蒸餾水漂洗，中性樹脂封片，全自動顯微鏡下觀察。

1.5 Real-time PCR取約60 mg的人體及大鼠主動脈標本，加入適量Trizol，液氮研磨儀研磨，提取組織中總RNA。紫外分光光度計測量其濃度及純度，純度在1.9～2.0為合格，方可進行下一步實驗。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對所得RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，采用SYBR Green染料法以BIO-RAD RTPCR儀為平臺，擴增條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延長20 s，共40個循環(huán)，β-Actin作為內(nèi)參，進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，定量分析實驗結(jié)果。所用主要引物條目及序列如下表：

1.6 Western-blot實驗按照分組要求處理組織后，取約60 mg組織于1.5 ml EP管內(nèi)，加入含有適量比例的Cocktail及PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，液氮研磨儀研磨組織；所得樣品于冷凍離心機中以4℃ 12 000 rpm/min離心20 min，取上清，所收集上清液冰上超聲碎裂。根據(jù)所獲得蛋白上清液的體積，以適當(dāng)?shù)谋壤尤氲鞍咨蠘泳彌_液混勻，100℃金屬浴15 min，所獲蛋白樣本凍存于-80℃冰箱中。每孔蛋白上樣量為20 ug，電泳電壓90 V，電流40 mA，以10%SDS-PAGE丙烯酰胺凝膠進行Western blot電泳。在電流200 mA，電壓100 V條件下電轉(zhuǎn)2 h。其后TBST洗膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗4℃孵育過夜，GAPDH為內(nèi)參，以羊抗鼠、羊抗兔熒光二抗顯影，在Odessy熒光掃膜系統(tǒng)上掃膜，并對結(jié)果進行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計分析以SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人體標本中，各組主動脈組織中ATF4及CHOP表達比較兩組人體主動脈組織標本，石蠟包埋、切片后經(jīng)間苯二酚染色發(fā)現(xiàn)，AD組患者主動脈血管組織中彈力纖維斷裂較Donor組正常主動脈血管明顯增多，說明所選取的主動脈夾層標本符合主動脈夾層發(fā)病后的血管組織病理改變。Masson染色發(fā)現(xiàn)，AD組患者血管組織中膠原沉積較Donor組正常主動脈血管明顯增多；通過TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，AD組患者血管組織內(nèi)凋亡VSMCs較Donor組血管組織內(nèi)凋亡細胞明顯增多（圖中紅色箭頭示凋亡陽性細胞），且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖1）。RT-PCR及Western-blot實驗發(fā)現(xiàn)，AD組患者主動脈血管ATF4、CHOP的表達在RNA水平及蛋白水平均較Donor組正常主動脈血管明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

2.2 動物實驗中，各組主動脈組織中ATF4及CHOP表達比較對兩組動物所獲得的血管標本石蠟包埋、切片后，進行間苯二酚染色，發(fā)現(xiàn)對照組基本無彈力纖維斷裂，AD組主動脈損傷部位組織彈力纖維斷裂較對照組明顯增多；Masson染色發(fā)現(xiàn)，AD組主動脈損傷部位組織膠原沉積較對照組顯著增多。以上病例特點均符合主動脈夾層發(fā)病組織的病理改變，這也說明主動脈夾層動物模型的構(gòu)建基本成功。通過TUNEL染色我們發(fā)現(xiàn)，AD組主動脈損傷部位主動脈平滑肌細胞凋亡較對照組顯著增加（圖中紅色箭頭所指即為凋亡陽性細胞），且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。RT-PCR及Western-blot實驗發(fā)現(xiàn)，AD組主動脈損傷部位組織CHOP及ATF4在RNA及蛋白水平均較對照組均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

3 討論

表1 不同種屬CHOP、ATF4、β-Actin特異性引物序列

本研究發(fā)現(xiàn)，人主動脈夾層血管組織標本中環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白（CHOP）和活性轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）的表達在mRNA水平及蛋白水平均較正常主動脈血管組織標本明顯增加，提示在主動脈夾層發(fā)病過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激明顯升高；同時，TUNEL染色顯示，主動脈夾層組織中VSMCs凋亡細胞數(shù)目明顯增多。因為人體組織標本之間存在年齡、性別、發(fā)病程度等多種差異，樣本均一性相對較差。為進一步驗證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平及相關(guān)蛋白在主動脈夾層發(fā)病過程中的表達，我們構(gòu)建了主動脈夾層動物模型。在動物實驗中也得到了一致的結(jié)論，進一步證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達升高可能與VSMCs凋亡具有密切的聯(lián)系。

圖1 兩組人體主動脈組織標本間二苯酚染色，Masson染色，TUNEL染色（400×）

圖3 各組大鼠主動脈組織間二苯酚染色，Masson染色，TUNEL染色（200×）

圖4 各組主動脈組織ATF4、CHOP蛋白及RNA表達水平

主動脈夾層作為一類極其危險的大血管疾病，基本病理變化表現(xiàn)為主動脈VSMCs的丟失和凋亡過多，彈力纖維斷裂，細胞外基質(zhì)膠原沉積過多[2]。其中，VSMCs的數(shù)目減少及凋亡增多，是主動脈舒縮功能障礙導(dǎo)致后期主動脈夾層發(fā)生發(fā)展的主要原因[4]。在主動脈夾層發(fā)生過程中，VSMCs受到炎癥、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、氧化應(yīng)激、血流剪切力等一系列外界刺激的影響，凋亡增多，進而使得主動脈結(jié)構(gòu)和功能受到影響，導(dǎo)致主動脈夾層的發(fā)生[5]。

許多因素可誘發(fā)主動脈VSMCs發(fā)生凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為機體細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的場所，對于維持機體細胞功能的正常運轉(zhuǎn)具有極其重要的作用。一旦機體內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，如氧化應(yīng)激、鈣穩(wěn)態(tài)失衡等，細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)受到破壞，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受到影響，蛋白質(zhì)折疊錯誤或未折疊蛋白集聚稱之為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后會進一步觸發(fā)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)（UPR）[6]。此時，監(jiān)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的一系列蛋白激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號通路蛋白如蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、肌醇需求蛋白（IRE-1）、活性轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4），使蛋白質(zhì)折疊能力增強，蛋白質(zhì)翻譯速率降低，并通過促進蛋白質(zhì)的降解來緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負荷，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平；若經(jīng)此過程內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不能有效緩解，則觸發(fā)凋亡相關(guān)蛋白的表達，導(dǎo)致細胞凋亡，進而影響機體或器官功能導(dǎo)致一系列臨床疾病的發(fā)生發(fā)展[7]。其中PERK/ATF4/CHOP對于細胞凋亡的調(diào)節(jié)具有極其重要的作用。

活性轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）由351個氨基酸構(gòu)成，作為PERK/ATF4/CHOP中的重要節(jié)點蛋白，通常在由PERK下游的真核起始因子2（eIF2）誘導(dǎo)下使其mRNA轉(zhuǎn)錄速率加快，蛋白表達水平升高，進而促進CHOP的表達入核，誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生[8]。CHOP也稱為GADD153，屬于CCAAT/增強子結(jié)合蛋白家族，與細胞增殖、分化及代謝的調(diào)節(jié)過程相關(guān)[9]。其主要由兩個功能域組成，一是N末端轉(zhuǎn)錄激活域和C末端堿性亮氨酸鏈式結(jié)構(gòu)域組成的富含堿性氨基酸的DNA結(jié)合區(qū)域；其次是亮氨酸鏈式二聚化基序。有研究將CHOP不同結(jié)構(gòu)域進行缺失突變發(fā)現(xiàn)，C末端堿性亮氨酸鏈式結(jié)構(gòu)域?qū)HOP介導(dǎo)的細胞凋亡極其重要[10]。在機體正常情況下，CHOP表達較低，而當(dāng)細胞內(nèi)過表達CHOP則會導(dǎo)致細胞周期阻滯，誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生[11]。研究發(fā)現(xiàn)，ERS通過CHOP可以調(diào)節(jié)許多細胞凋亡相關(guān)基因的表達，包括DOC、Bcl-2、TRB3和GADD34[12-14]。其中CHOP可以下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，進而促進細胞的凋亡[15]。同時，在CHOP敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠中，caspase-3、Bax活性及表達均明顯降低[16,17]。因此，CHOP可以通過多種途徑促進細胞凋亡的發(fā)生，對于細胞凋亡的發(fā)生具有極其重要的作用。

綜上所述，在主動脈夾層的發(fā)生過程中，多種因素刺激可內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白ATF4與CHOP表達顯著上調(diào)；若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)不能恢復(fù)，ATF4與CHOP則啟動細胞凋亡信號通路進而導(dǎo)致主動脈VSMCs的凋亡，促進主動脈夾層的發(fā)生發(fā)展。明確主動脈夾層發(fā)生的病理生理機制也為以后主動脈夾層的早期治療提供了新的治療思路與靶點。