馬曉菁，葉 鋒，劉麗婭，劉 帥，謝彩云，谷文喜，鐘 旗，馬俊杰，易新萍

(新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊 830013)

0 引 言

【研究意義】布魯菌病(Brucellosis，簡稱布病)是由布魯菌(Brucella)引起的一種嚴(yán)重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類公共衛(wèi)生安全的人畜共患病[1]。新疆是我國五大牧業(yè)基地之一，畜牧業(yè)在國民生產(chǎn)總值中占有非常重要地位，主要以布魯菌病屬的羊種菌和牛種菌為優(yōu)勢菌種的農(nóng)、牧區(qū)型和城市型布病老疫區(qū)[2]。近年來， 隨著家畜規(guī)?；B(yǎng)殖的興起和牲畜流動的加快，畜間布病發(fā)病率呈明顯上升趨勢，人間布病的發(fā)病數(shù)也逐年遞增[3]。由于帶菌動物是其他動物和人類布病的主要傳染源，因此，從源頭遏制畜間布病疫情上升趨勢是控制人間布病的重要前提。多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(multiple locus variable number tandem repeat analysis，MLVA)是近年發(fā)展起來的以PCR為基礎(chǔ)，根據(jù)被檢菌株散在基因組中不同位點(diǎn)的、變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)序列( variable number tandem repeat，VNTR)的重復(fù)單元拷貝數(shù)的差異進(jìn)行分子分型的技術(shù)[4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)技術(shù)具有高分辨率優(yōu)勢的多態(tài)性遺傳標(biāo)記，在評價(jià)疫苗效果、種系間遺傳與進(jìn)化以及疾病爆發(fā)的追蹤等方面起著重要作用。MLVA技術(shù)在布魯菌分型上應(yīng)用較為廣泛，2003年Bricker等[5]將高變量八聚物寡核苷酸指紋技術(shù)(HOOF-Prints)應(yīng)用到布魯菌的菌型鑒定中。隨著MLVA分型技術(shù)迅速發(fā)展，對VNTR位點(diǎn)的選擇也相對多樣化，根據(jù)VNTR數(shù)目的不同衍生出MLVA-15、MLVA-16、MLVA-17和MLVA-21等多種方案[6-7]。Marianne等[8]用MLVA-16對海洋哺乳動物布魯菌株分型，海洋動物布魯菌與陸地動物布魯菌存在差異，主要分為3個(gè)生物型。近年來，在我國利用MLVA技術(shù)對不同地區(qū)分離布魯菌進(jìn)行分型鑒定以及遺傳關(guān)系比較研究，用于追溯傳染源，確定流行趨勢。楊杰等[9]初步建立我國布魯菌MLVA-16分型方法。毛玲玲等[10]采用MLVA-16對遼寧地區(qū)人間分離33株布魯菌分型，研究結(jié)果表明，該地區(qū)布魯菌流行菌株存在豐富的基因多態(tài)性。任曉麗[11]等對1株新疆分離綿羊附睪種布魯菌MLVA-16方法結(jié)合常規(guī)生物學(xué)方法分析，結(jié)果顯示兩種分型方法種屬結(jié)果一致?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】為掌握新疆畜間布病流行病學(xué)特征，研究通過多重PCR方法和MLVA技術(shù)[12-14]對新疆2010-2015年分離的布魯菌進(jìn)行基因分型研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分析新疆畜間布病的流行特征及菌型基因特征情況，為新疆制定布病綜合性防控措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

對照標(biāo)準(zhǔn)菌株A19、M5和牛種3型布魯菌的DNA、牛羊布魯菌分離株均由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所布病組保存。

布氏瓊脂和肉湯培養(yǎng)基(美國BD公司)。PCR相關(guān)分子生物學(xué)試劑和細(xì)菌核酸提取試劑盒(北京全氏金生物技術(shù)有限公司)。PCR引物由上海英俊生物工程有限公司合成，PCR產(chǎn)物由北京鼎國生物工程有限公司測序。

1.2 方 法

1.2.1 AMOS-PCR法鑒定布魯菌種/型

參照參考文獻(xiàn)[15-16]中的AMOS-PCR方法及參數(shù)對新疆布魯菌分離株進(jìn)行布魯菌種/型的鑒定。

1.2.2 布魯菌MLVA分子分型

采用MLVA-16(16位點(diǎn)可變數(shù)目串連重復(fù)序列)分型方法，引物序列、擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件見文獻(xiàn)[17]。16個(gè)引物分為2組：panel 1( Bruce06、Bruce08、Bruce11、Bruce12、Bruce42、Bruce43、Bruce45、Bruce55 ),panel2A ( Bruce04、Bruce07、Bruce09 ) ，panel 2B ( Bruce16、Bruce18、Bruce19、Bruce21、Bruce30) 。MLVA反應(yīng)體系為25 μL：2×TaqPCR mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，模板DNA1.0 μL，ddH2O補(bǔ)至反應(yīng)體系25.0 μL，擴(kuò)增參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。Panel1的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳，1.8%瓊脂糖凝膠電泳，100 V，30 min。Panel 2的PCR產(chǎn)物采用毛細(xì)管電泳。其中panel 2引物上游5’端標(biāo)記熒光素(FAM)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物由北京鼎國生物工程公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物通過BioNumerics數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化為各位點(diǎn)的重復(fù)單元。通過http://mlva.u-psud.fr/MLVAnet與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，以確定分型。應(yīng)用非加權(quán)配伍組平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，將獲得的布魯菌分型與國際Brucella數(shù)據(jù)庫在線比較并進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMOS-PCR結(jié)果

研究表明，牛種布魯菌(1，2，4，3a型)擴(kuò)增出498 bp的特異性片段，牛種布魯菌(3b，5，6，9型)擴(kuò)增出1 700 bp的目的片段，羊種布魯菌(1，2，3型)擴(kuò)增出731 bp的目的片段。新疆地區(qū)的30株布魯菌分離株有26株為羊種布魯菌，4株為牛種布魯菌。圖1

M：Marker(DL2000)；1：羊種布魯菌M5疫苗株；2：牛種布魯菌A19疫苗株；3：牛種9型布魯菌；4：陰性對照；5-34：布魯菌分離株

2.2 布魯菌株MLVA位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)數(shù)

將16個(gè)VNTR位點(diǎn)的重復(fù)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物通過BioNumerics數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化為各位點(diǎn)的重復(fù)單元數(shù)。表1

表1 新疆布魯菌分離株MLVA位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)數(shù)Table 1 MLVA tandem reapeat of Brucella isolated in Xinjiang

2.3 新疆布魯菌MLVA-16聚類

MLVA-16分型方法中panel 1引物擴(kuò)增結(jié)果顯示，30株布魯菌有26株為羊種布魯菌，4株為牛種布魯菌，結(jié)果與AMOS-PCR種/型分型結(jié)果一致。BioNumerics6.6軟件聚類分析表明，新疆地區(qū)30株布魯菌可被分為10大基因群(A～J群)22個(gè)基因型。其中A群包含4個(gè)基因型4株菌，均與牛種布魯菌群聚為一簇。B～J群均與羊種布魯菌聚為一簇，其中B群、C群、D群及F群均為獨(dú)立基因型6株菌。E群包含3個(gè)基因型3株菌，G群包含4個(gè)基因型8株菌，H群包含2個(gè)基因型2株菌，I群包含2個(gè)基因型4株菌，J群包含3個(gè)基因型5株菌。圖2

圖2 新疆30株布魯菌分離株的MLVA-16聚類Fig.2 Dendrogram based on the MLVA-16 genotyping assay of the 30 Brucella strains in xinjiang

3 討 論

分離病原是確診布病的金標(biāo)準(zhǔn)，而對病原的種型鑒定是控制、預(yù)防和根除布病的重要環(huán)節(jié)。布魯菌傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)鑒定方法雖可以對病畜做出確切的診斷， 但鑒定耗時(shí)，操作步驟繁瑣，且對實(shí)驗(yàn)室操作人員具有較高的感染風(fēng)險(xiǎn)。MLVA分子分型方法具有快速、操作簡單、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),且便于實(shí)驗(yàn)室間的比較，可以作為傳統(tǒng)表型鑒定方法的補(bǔ)充[18-19]。研究中應(yīng)用MLVA-16分型方法對新疆2010～2015年間21個(gè)縣/市分離的30株布魯菌從種、型、株水平進(jìn)行鑒定，對菌株間的親緣關(guān)系開展分析研究，掌握了新疆畜間布病傳染源分布和疫情流行特征，為新疆制定布病綜合性防控方案提供前期基礎(chǔ)。

截止1990年，新疆從人體內(nèi)分出的布魯菌主要以牛種菌占優(yōu)勢[20]。全國近年的布病病原學(xué)監(jiān)測結(jié)果表明，羊種3型布魯菌是我國人間布病的主要流行菌型，其次是牛種菌[10、21-22]。研究中MLVA-16聚類分析顯示，4株牛種布菌有3株在panel 1的8個(gè)位點(diǎn)均為4-5-3-12-2-2-3-1，并有2株panel 2A的3個(gè)位點(diǎn) (Bruce18、Bruce19、Bruce21)也全部一致(6-21-8)；panel 1的4-5-3-12-2-2-3-1為牛種布魯菌的主要感染病原菌。與國內(nèi)牛種布魯菌(重慶、黑龍江、河北、內(nèi)蒙古)相比，新疆牛種布魯菌為獨(dú)立基因型，推測新疆是牛種布魯菌自然疫源地。盡管國內(nèi)分離的90%布魯菌均屬于羊種布魯菌，但不同地域的基因型也存在一定差異。中國南方(浙江、云南、福建省)與北方(山西、內(nèi)蒙古、遼寧、河北、山東、陜西)的布魯菌明顯屬于兩個(gè)獨(dú)立基因群。新疆26株羊種布魯菌中只有WS2株與山東分離株聚為一群(B群)，其他25株羊種菌均屬于獨(dú)立的基因型，即8個(gè)基因群(C～J群)17個(gè)基因型，新疆地區(qū)目前流行的布魯菌存在豐富的基因多態(tài)性。24株羊種布魯菌在panel 1的8個(gè)位點(diǎn)均為42型(1-5-3-13-2-2-3-2)，屬東地中海型；panel 2A的3個(gè)位點(diǎn) (Bruce18、Bruce19、Bruce21)也全部一致，均為4-20-8 型。在panel 2B的5個(gè)位點(diǎn)(Bruce04、07、09、16、30)中，Bruce04、Bruce07、Bruce09也有13株是完全相同的，均為4-4-3型；有4株菌的panel 2B的5個(gè)位點(diǎn)完全相同4-4-3-6-5(為G型)，羊種布魯菌在時(shí)間和區(qū)域上的感染源是相關(guān)聯(lián)的。G群基因型( 30.77% ) 為新疆目前主要的流行基因型。布魯菌MLVA-16聚類分析表明，新疆畜間布魯菌感染的主要流行病原菌為羊種42型，屬于東地中海型。

布魯菌的各型菌有其主要的感染宿主，但也能轉(zhuǎn)移于其它宿主，各型布魯菌在不同種動物間有跨物種間傳播現(xiàn)象[23]。從基因型多態(tài)性來看，研究中分離的7株羊種菌的宿主來源于牛，但其廣泛分布于5個(gè)基因群的6個(gè)基因型中。從菌株分離地點(diǎn)分析，阿勒泰地區(qū)分離的8株布魯菌廣泛分布于6個(gè)基因群的8個(gè)基因型中，菌株之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。南疆和北疆地區(qū)分離的布魯菌可聚類在相同基因型中(CBC1、HT1)，以上結(jié)果表明新疆分離到的布魯菌株顯示出豐富的基因多態(tài)性現(xiàn)象。綜上所述，近幾年新疆人間布病疫情明顯呈現(xiàn)擴(kuò)大蔓延之勢，主要與畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)活動有關(guān)。一方面，疆內(nèi)外牲畜養(yǎng)殖量大規(guī)模發(fā)展與牲畜交易日益頻繁是導(dǎo)致布病疫情上升的一個(gè)主要原因。 另一方面，牲畜檢疫、免疫及無序移動的監(jiān)管無保障。眾所周知，在不同的國家和地區(qū)，以至在一個(gè)國家的不同地方，各種動物作為傳染源的意義不盡相同[24]。

4 結(jié) 論

30株布魯菌中4株為牛種布魯菌，26株為羊種布魯菌。MLVA-16聚類分析結(jié)果表明，新疆地區(qū)30株布魯菌可被分為10大基因群(A～J群)22個(gè)基因型，新疆地區(qū)流行的布魯菌存在豐富的基因多態(tài)性。 MLVA -16方法對布魯菌種、生物型和菌株間差異有很高的鑒別力。