姚鳳琴 ，林發(fā)壯，陳昌銘，林輝鋒，夏朝水，鐘琳珊

(三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 福建 三明 365509)

非洲菊Gerberajamesonii，又名扶郎花、太陽(yáng)花等，是菊科大丁草屬多年生宿根草本花卉。非洲菊是世界五大鮮切花之一，原產(chǎn)于南非，現(xiàn)已全球化規(guī)模種植[1]。由于非洲菊受周年種植及固定栽培設(shè)施的限制，使非洲菊根腐病發(fā)病率逐年上升，尤其是春夏季的高溫高濕更能加快有害病原菌的增殖和傳播，是根腐病高發(fā)期，一般發(fā)病率為20%～30%，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)80%，已成為制約我國(guó)非洲菊產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素[2]。

目前針對(duì)非洲菊根腐病的防治主要以物理清除和化學(xué)藥劑噴施為主，而使用化學(xué)農(nóng)藥不僅帶來(lái)日趨嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題，還加速病原菌耐藥性的產(chǎn)生，加重了防治難度，提高了種植成本。近年來(lái)，隨著人們對(duì)綠色土地、生態(tài)環(huán)境修復(fù)的日益重視，利用有益微生物防治植物土傳病害已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)?？莶菅挎邨U菌是一種理想的生防微生物，已在棉花、番茄、辣椒、小麥、茄子、玉米、水稻、甜瓜、馬鈴薯、黃瓜等不同作物病害上得以成功應(yīng)用，并取得了良好的成效[3-12]。目前，枯草芽孢桿菌在非洲菊根腐病上應(yīng)用的研究還很少。本研究就枯草芽孢桿菌Bv17對(duì)非洲菊根腐病菌的抑制作用及溫室盆栽防效進(jìn)行了探討，以期為開(kāi)發(fā)一種有效防治非洲菊根腐病的生防菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

非洲菊根腐病病原菌菌株：隱地疫霉菌Phytophthoracryptogea、腐皮鐮刀菌Fusariumsolani分別從三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)院非洲菊種植基地的根腐病病株分離、鑒定獲得，分離方法參照謝為龍等[13]的方法；枯草芽孢桿菌Bv17由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所加工有害生物防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1枯草芽孢桿菌Bv17菌液的制備 活化枯草芽孢桿菌Bv17菌株，然后從該菌株的菌落邊緣挑取直徑為5 mm的菌塊接種于LB固體培養(yǎng)基上，并置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)5 d；之后，挑取LB固體培養(yǎng)基上的菌落邊緣直徑為5 mm的菌塊2塊，置于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，在30℃、200 r·min-1的搖床內(nèi)培養(yǎng)2 d；然后在5 000 r·min-1的條件下離心10 min后，倒掉上清液，加水稀釋菌體獲得濃度為5×106cfu·mL-1的枯草芽孢桿菌Bv17菌液備用。

1.2.2枯草芽孢桿菌Bv17對(duì)非洲菊根腐病菌抑制作用的測(cè)定 試驗(yàn)采用杯碟法，參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。處理組(BS)：將枯草芽孢桿菌Bv17菌液按1∶100的比例加入35～40℃的PDA培養(yǎng)基中，搖勻后倒入培養(yǎng)皿(φ9 cm)中，冷凝后分別接種直徑為0.8 cm的致病菌(隱地疫霉菌、腐皮鐮刀菌)菌碟，分別做3次重復(fù)，置于30℃下培養(yǎng)；以不添加枯草芽孢桿菌Bv17菌液的PDA培養(yǎng)基為空白對(duì)照組(CK)。培養(yǎng)2 d 后開(kāi)始觀察測(cè)定菌落直徑，抑菌率計(jì)算抑菌率，公式如下。

抑菌率=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑]× 100%

1.2.3枯草芽孢桿菌Bv17對(duì)非洲菊根腐病防效試驗(yàn) 處理1～4分別為枯草芽孢桿菌Bv17菌液濃度5×104、5×105、5×106、5×107cfu·mL-1處理，在枯草芽孢桿菌Bv17菌液中加細(xì)壤黃心土(經(jīng)孔徑4 mm園藝篩過(guò)篩)調(diào)成稀泥漿，其中枯草芽孢桿菌Bv17菌液和黃心土的配比為4∶1。將生長(zhǎng)良好的云南紅非洲菊穴盤(pán)苗拔出穴盤(pán)，并把其根系全部放進(jìn)枯草芽孢桿菌Bv17泥漿中1～2 min，稍轉(zhuǎn)動(dòng)該穴盤(pán)苗至泥漿蘸均后取出，之后再將該穴盤(pán)苗定植至裝有腐殖質(zhì)的花盆中。以蘸清水泥漿的為對(duì)照組(CK)，每個(gè)處理各30株，試驗(yàn)重復(fù)3次，置于(25±2)℃的溫室內(nèi)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為(1 500±200)lx，光照時(shí)間為12 h·d-1。

非洲菊種苗定植1個(gè)月后，用隱地疫霉菌發(fā)酵液(濃度為3×106cfu·mL-1)和腐皮鐮刀菌發(fā)酵液(濃度為3×106cfu·mL-1)1∶1配比混合液進(jìn)行灌根處理，每株25 mL，從處理后第3 d開(kāi)始觀察統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。按發(fā)病率及病情指數(shù)記錄發(fā)病情況，病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照李越等的方法[14]。

病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)-無(wú)??；1級(jí)-1/2以下葉片萎蔫；2級(jí)-1/2以上葉片萎蔫，但未完全萎蔫；3級(jí)-全部葉片均萎蔫，有的葉片開(kāi)始干枯；4級(jí)-全株枯死。

病情指數(shù) = 100×∑(各級(jí)病株數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)) /(調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最重級(jí)數(shù))

相對(duì)防效 = (對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)) /對(duì)照區(qū)病情指數(shù)×100%

發(fā)病率 = 發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌Bv17對(duì)非洲菊根腐病病菌的抑菌效果

杯碟法測(cè)定結(jié)果(表1～2、圖1)表明，培養(yǎng)初期，BS處理組與對(duì)照組隱地疫霉菌菌落均為圓形放射狀向外擴(kuò)展，且有氣生菌絲；培養(yǎng)至第4 d時(shí)，BS處理組隱地疫霉菌菌落已停止向四周擴(kuò)展，平均直徑為2.21 cm，氣生菌絲逐漸消失，外邊緣菌絲逐漸變褐，而對(duì)照組隱地疫霉菌菌落直徑已達(dá)5.78 cm，且持續(xù)圓形放射狀向外擴(kuò)展；培養(yǎng)至第6 d時(shí)，BS處理組隱地疫霉菌菌落氣生菌絲消失，菌落萎縮，菌落周邊有明顯的褐色帶，菌落直徑為2.07 cm，而對(duì)照組隱地疫霉菌菌落直徑已達(dá)7.85 cm，抑菌率達(dá)73.63%。培養(yǎng)初期，BS處理組腐皮鐮刀菌菌絲有少許向上蓬松生長(zhǎng)，但基本不向四周擴(kuò)展，對(duì)照組腐皮鐮刀菌菌絲圓形放射狀向外擴(kuò)展，且有氣生菌絲；培養(yǎng)至第4 d時(shí)，BS處理組腐皮鐮刀菌菌絲向上蓬松生長(zhǎng)，但不向四周擴(kuò)展，菌落直徑只有1.21cm，而對(duì)照組腐皮鐮刀菌菌落直徑已達(dá)4.15 cm，且持續(xù)圓形放射狀向外擴(kuò)展；培養(yǎng)至第 6 d時(shí)，BS處理組腐皮鐮刀菌菌落直徑為1.21 cm，對(duì)照組腐皮鐮刀菌菌落直徑為8.31 cm，抑菌率達(dá)85.44%(圖2)。綜上表明，枯草芽孢桿菌Bv17菌液對(duì)非洲菊根腐病兩種病原菌隱地疫霉菌和腐皮鐮刀菌均有較好的抑制效果。

表1枯草芽孢桿菌Bv17對(duì)隱地疫霉菌的抑菌效果

Table1AntibacterialeffectofBacillussubtilisBv17onPhytophthoracryptogea

培養(yǎng)時(shí)間菌落直徑(cm)CKBS抑菌率(%)第2 d2.26±0.132.03±0.1310.18第3 d3.87±0.112.21±0.0842.89第4 d5.78±0.142.21±0.0861.76第6 d7.85±0.172.07±0.0973.63

注：表中BS為添加枯草芽孢桿菌Bv17菌液處理組，CK為不添加枯草芽孢桿菌Bv17菌液；表2同。

表2枯草芽孢桿菌對(duì)腐皮鐮刀菌的抑菌效果

Table 2 Antibacterial effect ofBacillussubtilisonFusariumsolani

培養(yǎng)時(shí)間菌落直徑(cm)CKBS抑菌率(%)第2 d1.43±0.090.91±0.0236.36第3 d2.52±0.121.21±0.0551.98第4 d4.15±0.111.21±0.0570.84第6 d8.31±0.141.21±0.0585.44

圖1 枯草芽孢桿菌Bv17對(duì)隱地疫霉菌的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of Bacillus subtilis Bv17 on Phytophthora cryptogea注：圖中A為不添加枯草芽孢桿菌Bv17菌液對(duì)照組，B為添加枯草芽孢桿菌Bv17菌液處理組；圖2同。

圖2 枯草芽孢桿菌Bv17對(duì)腐皮鐮刀菌的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of Bacillus subtilis Bv17 on Fusarium solani

2.2 枯草芽孢桿菌Bv17對(duì)非洲菊根腐病的防治效果

枯草芽孢桿菌Bv17處理組非洲菊種苗基本健康生長(zhǎng)(圖3A)；對(duì)照組大部分植株葉片第6 d開(kāi)始出現(xiàn)輕微失水，根部有輕微的黏著感，于第10 d時(shí)，植株發(fā)生整株性萎蔫，根莖部變黑褐色、變軟、水漬狀、皮層腐爛脫落，植株開(kāi)始逐漸干枯死亡(圖3B)。病原菌灌根后15 d發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)列于表2。從表2可以看出，在室內(nèi)盆栽試驗(yàn)中，不同濃度處理的枯草芽孢桿菌Bv17均可大幅度地降低非洲菊根腐病的病情指數(shù)，具有良好的防治效果，不同濃度處理間防治效果差異達(dá)顯著水平，防治效果隨著枯草芽孢桿菌Bv17濃度的增加而提高。在供試濃度范圍內(nèi)枯草芽孢桿菌Bv17對(duì)非洲菊根腐病的相對(duì)防效均達(dá)70%以上，而濃度為5×107cfu·mL-1時(shí)防治效果最好，病情指數(shù)為2.50，相對(duì)防效高達(dá)97.32%。

表3枯草芽孢桿菌Bv17對(duì)非洲菊根腐病的防治效果

Table3ControleffectofBacillussubtilisBv17onrootrotofGerberajamesonii

處理發(fā)病率(%)病情指數(shù)相對(duì)防效(%)5(CK)100.0093.33-133.3327.5070.52±2.53 a223.3316.6782.14±3.55 b316.678.8990.45±2.88 c46.672.5097.32±1.56 d

注：表中同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

圖3 枯草芽孢桿菌Bv17對(duì)非洲菊根腐病的防治效果Fig.3 Control effect of Bacillus subtilis Bv17 on root rot of Gerbera jamesonii 注：A為枯草芽孢桿菌Bv17泥漿蘸根的非洲菊，B為清水泥漿蘸根的非洲菊。

3 結(jié)論與討論

在土傳病害發(fā)生的根際土壤環(huán)境中，不僅存在病原菌，還存在大量的拮抗菌，利用拮抗菌防治植物土傳病害已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，具有廣闊的的應(yīng)用前景[15]。枯草芽孢桿菌抑菌譜廣、分布廣、生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單，并對(duì)多種植物土傳病害具有良好的防病效果，是目前植保研究者研究最多的生防細(xì)菌之一[16]。枯草芽孢桿菌既可產(chǎn)生細(xì)菌素類(lèi)、酶類(lèi)、活性蛋白質(zhì)類(lèi)、脂肽類(lèi)、多肽類(lèi)等多種抑菌物質(zhì)抑制病原菌的生長(zhǎng)；又可誘導(dǎo)植物自身抗病機(jī)制，進(jìn)而提高植物自身免疫能力，增強(qiáng)植物的抗病性能[17]。

非洲菊根腐病主要是由隱地疫霉菌和腐皮鐮刀菌引起的一種真菌性土傳病害，長(zhǎng)期以來(lái)主要使用化學(xué)農(nóng)藥防治，不僅防治效果不理想還會(huì)造成環(huán)境污染，生物防治既高效又綠色環(huán)保，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，因此研究開(kāi)發(fā)一種能夠有效防治非洲菊根腐病的生物菌劑，對(duì)非洲菊產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。侯彩霞等[18]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌可使瓜果腐霉菌菌絲體發(fā)生解體、菌絲細(xì)胞發(fā)生扭曲、原生質(zhì)濃縮，可有效防治加工番茄根腐病。趙長(zhǎng)龍等[19]也發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對(duì)菜豆根腐病菌腐皮鐮孢菌絲的生長(zhǎng)、孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)等都能產(chǎn)生有效的抑制作用。本試驗(yàn)利用杯碟法研究了枯草芽孢桿菌Bv17對(duì)非洲菊根腐病菌的抑制作用，結(jié)果表明枯草芽孢桿菌Bv17對(duì)兩種病原菌隱地疫霉素和腐皮鐮刀菌均有明顯的抑制效果，抑制率均在70%以上。但枯草芽孢桿菌Bv17對(duì)隱地疫霉菌、腐皮鐮刀菌兩種病原菌的作用機(jī)制不同，枯草芽孢桿菌Bv17在生長(zhǎng)過(guò)程中可能產(chǎn)生了某種物質(zhì)使隱地疫霉菌氣生菌絲消失，菌落萎縮，菌落周邊產(chǎn)生明顯的褐色帶；而對(duì)于腐皮鐮刀菌，枯草芽孢桿菌Bv17則是一直抑制其菌落向四周擴(kuò)展生長(zhǎng)。因此枯草芽孢桿菌Bv17對(duì)非洲菊根腐病病菌的作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步探索研究。

室內(nèi)盆栽防效試驗(yàn)結(jié)果表明枯草芽孢桿菌Bv17菌液對(duì)非洲菊根腐病具有較好的防治效果，防效高達(dá)97.32%。本研究是在實(shí)驗(yàn)室和溫室可調(diào)控條件下進(jìn)行，而關(guān)于在錯(cuò)綜復(fù)雜的室外環(huán)境條件下生防菌劑的效果是否穩(wěn)定還有待于下一步研究。