郭剛 陳文政 張帆 張旭

1中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院泌尿外科100853北京

腎上皮樣血管平滑肌脂肪瘤（epithelioid ano?myolipoma，EAML）為腎血管平滑肌脂肪瘤的少見(jiàn)亞型，是一種來(lái)源于血管周上皮樣細(xì)胞的間葉性腫瘤[1-2]。腎EAML在臨床少見(jiàn)，文獻(xiàn)多見(jiàn)于個(gè)案報(bào)道，該類腫瘤具有惡性潛能并呈現(xiàn)高侵襲性生物學(xué)行為，可發(fā)生局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和死亡等情況[3]，目前仍無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的治療方案。本研究對(duì)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院2014年10月－2017年10月收治的5例侵襲性腎上皮樣血管平滑肌脂肪瘤進(jìn)行包括手術(shù)和依維莫司藥物的綜合治療，取得了良好的臨床效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料及方法

1.1 臨床資料

收集5例侵襲性腎EMAL患者的臨床資料，包括臨床癥狀、腫瘤大小、病理學(xué)和影像學(xué)特點(diǎn)、手術(shù)方式及隨訪情況。5例患者均因腎腫瘤手術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移就診，男女比例為2∶3，年齡27～60歲，平均（39.8±11.5）歲。左側(cè)2例，雙側(cè)3例。3例患者首次手術(shù)接受根治性腎切除，2例首次手術(shù)接受腎部分切除。5例患者在首次手術(shù)后7～100個(gè)月后出現(xiàn)疾病進(jìn)展，中位至疾病進(jìn)展時(shí)間30個(gè)月；局部復(fù)發(fā)3例、多發(fā)轉(zhuǎn)移2例；其中2例復(fù)發(fā)患者均接受二次手術(shù)切除病灶，1例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者行右肩胛骨轉(zhuǎn)移灶切除術(shù)，另2例患者未接受手術(shù)治療。2例患者符合結(jié)節(jié)性硬化的臨床診斷，2例通過(guò)基因檢測(cè)確診為結(jié)節(jié)性硬化，1例不伴有結(jié)節(jié)性硬化。所有患者病理診斷均為上皮樣腎血管平滑肌脂肪瘤，所有病例均為HMB45染色陽(yáng)性，其中病例1、3、5的Ki-67陽(yáng)性率超過(guò)20%，核分裂像超過(guò)2/10 HPF。病例2、4的Ki-67陽(yáng)性率均為3%，核分裂像均為1～2/10 HPF，詳表1。

1.2 TSC1/2基因二代測(cè)序

1.2.1 目標(biāo)序列捕獲與測(cè)序 抽取受試者及對(duì)照者靜脈血5 mL，按標(biāo)準(zhǔn)流程提取基因組DNA（QIAamp DNA Blood Midi Kit，Qiagen，Hilden，Germany）。利用 Covaris LE220超聲波儀（Mas?sachusetts，USA）將基因組DNA打斷成200～250 bp的片段，隨后進(jìn)行Ampure Beads純化，將純化后的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)、加“A”以及加接頭反應(yīng)，從而完成單個(gè)受檢者的DNA建庫(kù)。Non-Captured樣品進(jìn)行LM-PCR反應(yīng)，純化，利用定制的基因片段捕獲探針（BGI自主探針），65℃雜交捕獲24 h，雜交結(jié)束后進(jìn)行探針的洗滌和洗脫反應(yīng)，隨后進(jìn)行Captured樣品的LM-PCR反應(yīng)。文庫(kù)經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOne進(jìn)行片段大小、濃度的檢測(cè)，最后利用高通量測(cè)序儀 Illumina HiSeq2500 Analyzers（Illumi?na，SanDiego，USA）連續(xù)雙向測(cè)序90個(gè)循環(huán)，用Illumina Pipeline software（version 1.3.4）讀出原始測(cè)序數(shù)據(jù)。

1.2.2 序列分析 數(shù)據(jù)下機(jī)后進(jìn)入信息分析部分。首先對(duì)下機(jī)的原始數(shù)據(jù)（Raw reads）進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估，去除低質(zhì)量以及被接頭污染的數(shù)據(jù)。隨后用BWA軟件（Burrows Wheeler Align?er）與HG19進(jìn)行序列比對(duì)，與此同時(shí)進(jìn)行序列捕獲效果評(píng)價(jià)，用SOAPsnp軟件和Samtools軟件分別進(jìn)行 SNV（single nucletide variant）和 Indel（insertion and deletion）的查詢，生成目標(biāo)區(qū)域堿基多態(tài)性結(jié)果，隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI dbSNP，HapMap，1000 human genome dataset和 data?base of 100 Chinese healthy adults）的比對(duì)，并對(duì)找出的可疑突變進(jìn)行注釋、篩選。

表1 患者臨床資料

1.2.3 Sanger法驗(yàn)證 對(duì)于所有發(fā)現(xiàn)的致病突變，在其所在片段上下游設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)產(chǎn)物做Sanger測(cè)序。將所得結(jié)果與TSC1和TSC2基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，從而驗(yàn)證探針捕獲和高通量測(cè)序的結(jié)果。

1.3 依維莫司藥物治療與評(píng)價(jià)

對(duì)所有患者給予依維莫司（諾華制藥，瑞士）藥物治療，起始劑量均為10 mg口服，1次/d，連續(xù)用藥。藥物治療直至疾病進(jìn)展或者出現(xiàn)需要減量或停藥的Ⅲ級(jí)或Ⅳ級(jí)藥物不良反應(yīng)。定期評(píng)估患者藥物治療的療效、血藥濃度及不良反應(yīng)發(fā)生情況。

依維莫司治療前，所有患者均采用螺旋CT或者M(jìn)RI測(cè)定腫瘤病灶，以最大直徑腫瘤作為靶病灶，應(yīng)用實(shí)體瘤評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判定療效（RECIST 1.0）[4]。分別于治療后第 1、3、6、12 個(gè)月進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，之后每6個(gè)月進(jìn)行療效評(píng)價(jià)。不良反應(yīng)每周期進(jìn)行評(píng)價(jià)，按照《美國(guó)國(guó)立癌癥研究所不良事件通用術(shù)語(yǔ)標(biāo)準(zhǔn)》（NCI CTCAR 3.0版2006年8月）進(jìn)行分級(jí)[5]。依維莫司的血藥濃度通過(guò)檢測(cè)血清雷帕霉素血藥濃度并通過(guò)公式換算得出[6]。

2 結(jié)果

2.1 TSC1/2基因二代測(cè)序

BWA軟件行序列捕獲效果評(píng)價(jià)顯示，所有樣本NGS平均堿基覆蓋度為99.88%，最低樣本覆蓋度為99.44%。目標(biāo)區(qū)域平均測(cè)序深度＞30X位點(diǎn)所占比例平均值為98.92%，最低值為97.35%。所有樣本的平均測(cè)序深度為280.4X，最低測(cè)序深度為168.4X。而且TSCl和TSC2基因各外顯子上的平均測(cè)序深度與測(cè)序深度中位數(shù)均比較接近，表明目標(biāo)序列捕獲二代測(cè)序的隨機(jī)性較好。

共檢測(cè)到有臨床意義的TSC2突變3例、TSC1突變1例，均為錯(cuò)義突變，另有1例患者檢測(cè)到TSC1的點(diǎn)突變，屬于良性突變（表2）。通過(guò)對(duì)比以往文獻(xiàn)及LOVD數(shù)據(jù)庫(kù)MJ[7]，有1個(gè)臨床意義未明確的突變，病例1的TSC1外顯子15的c.1700C＞T錯(cuò)義突變?；驒z測(cè)與臨床診斷的符合率為60%（3/5）。

應(yīng)用常規(guī)Sanger測(cè)序?qū)?例NGS檢測(cè)到5種突變位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，其結(jié)果與目標(biāo)序列捕獲測(cè)序結(jié)果完全一致，符合率100%。

2.2 依維莫司藥物療效與安全性評(píng)價(jià)

5例患者均接受口服依維莫司治療，治療持續(xù)時(shí)間3～16個(gè)月，治療1個(gè)月時(shí)的初始療效評(píng)估：PR4例、SD1例，平均腫瘤最大徑從8.5 cm縮小為6.4 cm；治療3個(gè)月療效評(píng)估：PR4例，SD1例，平均腫瘤最大徑為5.2 cm（圖1），6個(gè)月時(shí)腫瘤直徑變化不顯著（圖2）。隨訪3～20個(gè)月，4例患者病情穩(wěn)定，1例患者用藥16個(gè)月后出現(xiàn)疾病進(jìn)展。4例通過(guò)臨床診斷或基因診斷為結(jié)節(jié)性硬化的患者療效顯著優(yōu)于不伴有結(jié)節(jié)性硬化的患者，而是否伴有TSC1/2基因突變與依維莫司療效間無(wú)顯著相關(guān)性。

主要不良反應(yīng)包括口腔黏膜炎5例、皮疹2例、貧血2例、月經(jīng)失調(diào)2例、肝功能異常1例，大部分為1～2級(jí)不良反應(yīng)，不需要停藥或減低劑量，給予對(duì)癥處理后可緩解。1例患者用藥9個(gè)月出現(xiàn)3級(jí)肝功能不全，檢測(cè)雷帕霉素血藥濃度結(jié)果谷濃度為15.18 μg/L，換算依維莫司血藥濃度為19.7 μg/L，暫停依維莫司并給予積極保護(hù)肝功能治療后緩解，遂重新開(kāi)始依維莫司治療，劑量調(diào)整為5 mg口服，1次/d，復(fù)查依維莫司血藥濃度為 7.4 μg/L。

表2 患者TSC1/2基因二代測(cè)序結(jié)果

圖1 病例5患者依維莫司治療前后CT對(duì)比

圖2 依維莫司治療后腫瘤最大直徑變化

3 討論

腎EAML是一類比較罕見(jiàn)的腎臟腫瘤，其發(fā)病率不到所有腎腫瘤的1%，約占腎血管平滑肌脂肪瘤的4.6%[2]。該病好發(fā)于腎臟皮質(zhì)，成年女性多見(jiàn)，Aydin等[1]報(bào)道腎 EAML 患者較經(jīng)典AML更趨于年輕化。與經(jīng)典AML不同，腎EM?AL以上皮樣細(xì)胞為主，缺乏脂肪組織[8]，腫瘤多呈良性發(fā)展過(guò)程，因此其臨床表現(xiàn)缺乏特異性，故腫瘤體積小時(shí)常無(wú)任何癥狀，多由查體時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)。腎EMAL術(shù)前診斷主要依賴于影像學(xué)檢查，但其影像學(xué)特征存在多種變化，部分腫瘤呈侵襲性表現(xiàn)，可侵犯鄰近器官或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，容易造與其他類型腎腫瘤混淆而誤診。本研究組中有4例患者首次發(fā)病因腰痛就診，1例因血尿就診，MRI檢查均為乏脂肪占位，其中2例臨床診斷符合結(jié)節(jié)性硬化癥表現(xiàn)。

腎EMAL具有獨(dú)特的生物學(xué)行為，其惡性診斷和預(yù)后參數(shù)尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。2015年Lei等[9]依據(jù)腫瘤標(biāo)本及病理學(xué)特點(diǎn)提出新的預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：①腫瘤直徑大于9 cm；②靜脈瘤栓形成；③上皮樣細(xì)胞成分大于70%或不典型的分裂像細(xì)胞大于60%；④發(fā)現(xiàn)壞死。當(dāng)腫瘤符合至少3項(xiàng)視為有高度惡性生物學(xué)行為，需要臨床密切關(guān)注。Var?ma等[10]發(fā)現(xiàn)腎EMAL腫瘤P53陽(yáng)性提示有惡性變的趨勢(shì)，并提出Ki-67、P53有助于該類腫瘤良惡性的評(píng)估。本組患者中所有病例均為HMB45染色陽(yáng)性，其中病例1、3、5均為多發(fā)轉(zhuǎn)移，其共同特點(diǎn)是Ki-67陽(yáng)性率超過(guò)20%，核分裂像超過(guò)2/10 HPF。而病例2、4的Ki-67陽(yáng)性率均為3%，核分裂像均為1～2/10 HPF。病例5年輕女性患者在人工流產(chǎn)后短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)腫瘤快速進(jìn)展，值得關(guān)注。Tsai等[11]研究發(fā)現(xiàn)半數(shù)以上腎EAML伴有家族結(jié)節(jié)性硬化癥（tuberous sclerosis，TSC）或其他部位的腫瘤。有報(bào)道稱腎EMAL患者伴隨結(jié)節(jié)硬化癥的比例明顯高于經(jīng)典型腎AML，20%～30%的青年腎EAML患者合并結(jié)節(jié)性硬化癥[12]。本組患者均接受了TSC1/2基因檢測(cè)，4例發(fā)現(xiàn)致病性TSC1或TSC2基因突變，其中2例符合結(jié)節(jié)性硬化臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，占同期我院診斷EAML患者的30.8%（4/13）。

腎EMAL目前的治療方案沒(méi)有統(tǒng)一規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，手術(shù)切除是主要的有效治療方式，而完整的腫瘤切除可提高治療效果[13]。在手術(shù)方式的選擇上，應(yīng)根據(jù)患者腫瘤大小、位置、周圍組織侵犯及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等情況綜合評(píng)估，本組5例患者中3例在術(shù)后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)，因此在術(shù)中徹底切除腫瘤尤為重要。目前部分學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)腎EMAL對(duì)阿霉素、環(huán)磷酰胺、順鉑等化療藥物治療有一定療效，同時(shí)也有個(gè)案報(bào)道腎EMAL對(duì)于放療、化療及分子靶向治療均不敏感[14-16]。Kenerson等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路的異常激活在腎EAML的生長(zhǎng)及進(jìn)展中起重要作用，部分患者應(yīng)用雷帕霉素、依維莫司等mTOR抑制劑出現(xiàn)瘤體縮小，說(shuō)明mTOR抑制劑可對(duì)上皮樣血管平滑肌脂肪瘤有一定的治療作用。在一項(xiàng)多中心隨機(jī)對(duì)照前瞻性臨床研究（EXIST-2）中，79例臨床診斷為TSC相關(guān)EAML患者接受了6個(gè)月的依維莫司藥物治療，42%的依維莫司組患者腎臟EAML病灶體積縮?。?0%，而對(duì)照組未出現(xiàn)病灶體積縮小的病例[19-20]。而依維莫司在侵襲性EAML治療中的應(yīng)用僅有個(gè)案報(bào)道[21-22]。本組有4例患者考慮為結(jié)節(jié)性硬化相關(guān)的EAML，給予依維莫司治療1個(gè)月后瘤體明顯減小，腫瘤持續(xù)縮小至要治療后6個(gè)月，其療效持續(xù)穩(wěn)定達(dá)12個(gè)月，目前僅有1例出現(xiàn)進(jìn)展，而另外1例非結(jié)節(jié)性硬化相關(guān)的EAML患者使用依維莫司后腫瘤變化不明顯。我們選擇了既往治療結(jié)節(jié)性硬化相關(guān)腎血管平滑肌脂肪瘤的給藥劑量10 mg/d作為初始劑量，不良反應(yīng)多為1～2級(jí)，3～4級(jí)不良反應(yīng)發(fā)生率低，用藥期間進(jìn)行定期的安全性檢查及血藥濃度監(jiān)測(cè)將有效避免嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生，并可根據(jù)血藥濃度進(jìn)行合理的劑量滴定，合理的藥物滴定有助于患者長(zhǎng)期安全地接受藥物治療。

綜上所述，侵襲性腎EMAL是一種具有惡性潛能的腫瘤，完整的腫瘤切除是治療的關(guān)鍵。對(duì)于術(shù)前評(píng)估難以完整切除或者術(shù)后出現(xiàn)疾病進(jìn)展的患者應(yīng)進(jìn)行TSC1和TSC2基因突變分析，對(duì)于存在致病性TSC1/2基因突變或臨床診斷為結(jié)節(jié)性硬化的患者，依維莫司的應(yīng)用可以增加手術(shù)完整切除的概率，還可以有效控制局部復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移病灶，其療效還安全性還需要進(jìn)一步的大樣本前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究來(lái)證實(shí)。