曹訪 郭良勇 殷雨洋 蔣永清 李玉峰 王衛(wèi)星

摘要：試驗(yàn)旨在研究不同稀釋液對(duì)湖羊精液的4 ℃保存效果，同時(shí)探討不同種類(lèi)及濃度的冷凍保護(hù)劑對(duì)湖羊精液冷凍保存效果的影響。選擇6種常見(jiàn)的綿羊精液稀釋液配方，檢測(cè)湖羊精液稀釋后精子活力變化，分析精子存活時(shí)間及生存指數(shù);另選取6種常見(jiàn)的精子冷凍保護(hù)劑，分3組濃度（5%、10%、15%）添加，檢測(cè)細(xì)管凍精解凍后的精子活率。結(jié)果表明，6種稀釋液對(duì)湖羊精液的4 ℃保存效果存在顯著差異，其中F稀釋液保存效果最佳。冷凍保護(hù)劑的種類(lèi)和添加比例對(duì)湖羊精液的冷凍保存效果都存在影響，稀釋液中添加5%的丙三醇對(duì)湖羊精液的冷凍保存效果最佳。

關(guān)鍵詞：湖羊;精液;精子活力;稀釋液;冷凍保護(hù)劑;篩選

中圖分類(lèi)號(hào)： S826.3+4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）23-0201-03

湖羊是我國(guó)南方地區(qū)特有的國(guó)家級(jí)畜禽資源保護(hù)綿羊品種，主要分布于江浙滬一帶的太湖流域，具有獨(dú)特的波浪形羔皮、多羔、生長(zhǎng)速度快等諸多優(yōu)良性能。目前，在綿羊品種改良、選育過(guò)程中，人工授精技術(shù)因?yàn)榉N公羊利用率高、母羊便于集中管理、可加快選育進(jìn)程等優(yōu)點(diǎn)，在繁殖領(lǐng)域逐漸受到推崇。相關(guān)配套技術(shù)諸如優(yōu)秀稀釋液的開(kāi)發(fā)及冷凍保護(hù)劑的研究，也因?yàn)榭蛇M(jìn)一步發(fā)揮種公羊的利用潛能、實(shí)現(xiàn)遺傳資源保護(hù)等原因而受到研究人員的關(guān)注。韓天龍等研究表明，4 ℃ 條件下好的稀釋液可使羊精子在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持60%以上的活率[1]。滿都拉發(fā)現(xiàn)，在合理稀釋倍數(shù)下采用優(yōu)秀稀釋液稀釋輸精不影響羊的受精率[2]。朱志偉等則證實(shí)了冷凍精液用于保存動(dòng)物資源的可行性，研究證明添加抗冷凍保護(hù)劑丙三醇可使凍精解凍后保持較好的活力[3]。

近年來(lái)，綿羊精液的稀釋及冷凍保存技術(shù)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，如精液稀釋液的開(kāi)發(fā)以及冷凍保存技術(shù)的研究[4]，但單獨(dú)針對(duì)太湖地區(qū)湖羊的研究與應(yīng)用較少，并且綿羊精液的低溫稀釋保存效果及抗冷凍保存技術(shù)尚存在進(jìn)一步改善的空間。本研究擬采用不同稀釋液配方對(duì)湖羊精液開(kāi)展稀釋?zhuān)瑢?duì)精液稀釋保存效果進(jìn)行比較，以篩選出適合湖羊精液的最佳稀釋液。同時(shí)，在此稀釋液基礎(chǔ)上，研究不同冷凍保護(hù)劑及添加濃度對(duì)湖羊精液冷凍保存效果的影響，以篩選出適合湖羊精液冷凍保存的最佳冷凍保護(hù)劑，從而進(jìn)一步挖掘優(yōu)秀湖羊種公羊的利用潛能，并為當(dāng)?shù)氐暮蚬┓N及保種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)選用長(zhǎng)興昌達(dá)羊業(yè)有限公司所提供的3只優(yōu)秀種公羊，年齡為2～3歲，試驗(yàn)選用種公羊膘情為中上等，體質(zhì)健壯，按常規(guī)進(jìn)行飼養(yǎng)管理。

1.2 配方

1.2.1 稀釋液配方 試驗(yàn)選擇了6種稀釋液配方，標(biāo)記為配方A、B、C、D、E和F，詳見(jiàn)表1。按試驗(yàn)需要和稀釋液配方中的比例稱(chēng)取表1中各物質(zhì)，溶于蒸餾水中，用濾紙過(guò)濾，于110 ℃高壓10 min，取出靜置至室溫備用。取新鮮潔凈雞蛋，小心敲除外殼，去掉蛋清，把包有完整卵黃膜的卵黃放在潔凈平皿內(nèi)，用無(wú)菌的去針頭注射器刺破卵黃膜，緩慢抽取卵黃，加入到上述溶液中。將配制好的稀釋液置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 冷凍保護(hù)液配方 選擇4 ℃條件下保存效果最好的稀釋液作為基礎(chǔ)液，選擇6種常見(jiàn)的冷凍保護(hù)劑，按照試驗(yàn)要求添加到基礎(chǔ)液中，溶解后制成冷凍保護(hù)液，置于4 ℃冰箱中備用。冷凍保護(hù)劑添加比例見(jiàn)表2。

1.3 精液處理

1.3.1 精液稀釋保存 采集湖羊精液，經(jīng)活力檢測(cè)及品質(zhì)鑒定后，等量分裝于滅菌的試驗(yàn)管內(nèi)，在35 ℃等溫條件下按照稀釋程序要求，加入預(yù)溫的6種稀釋液，分2次等比例稀釋至4倍，細(xì)管灌裝后，用紗布包裹細(xì)管并裝入離心管，將離心管置于盛35 ℃溫水的大燒杯內(nèi)，然后將燒杯迅速置于4 ℃冰箱，緩緩降溫至4 ℃保存。每隔24 h鏡檢精子活率，鏡檢時(shí)操作溫度控制在35 ℃左右。

1.3.2 精液冷凍保存 采集湖羊精液，在35 ℃恒溫條件下，按照試驗(yàn)要求采用添加冷凍保護(hù)劑的稀釋液將精液分2次等比例稀釋至4倍體積，然后將稀釋好的精液放入4 ℃冰箱緩緩降溫，1.5 h后在4 ℃條件下分裝至凍存管并平衡2 h，然后按照凍存程序?qū)⒕簝龃?。按照試?yàn)安排，依照解凍程序?qū)⒓?xì)管凍精解凍，檢測(cè)精子活率。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)精子活率

解凍后的精子，按照說(shuō)明用Live/Dead sperm viability Kit（L-7011）（Sigma）試劑盒進(jìn)行染色，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)（BD FACSCanto Ⅱ）。

1.5 效果判定

精子活率為直線運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)占視野中總精子數(shù)的百分比;精子存活時(shí)間為99%的精子死亡的存活時(shí)間;精子有效存活時(shí)間是指精子活率不低于0.5的保存時(shí)間;精子生存指數(shù)是指相鄰2次精子活率的平均數(shù)與間隔時(shí)間乘積的總和。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋液對(duì)湖羊精液4 ℃稀釋保存效果的影響

2.1.1 6種稀釋液對(duì)精子活率的影響 由圖1可知，在4 ℃保存條件下，6種稀釋液中的湖羊精子活率隨時(shí)間增加而逐漸降低，保存效果存在明顯差異。A、B、C、D 4種稀釋液保存效果較差，A稀釋液中精子活率在1 d后顯著下降;B、C、D稀釋液中精子活率在3 d后顯著下降;E、F稀釋液中的精子保存效果比較理想，2種稀釋液中精子活率在6 d內(nèi)都能保持在0.6以上;6 d后， E稀釋液中的精子活率降低速度要顯著快于

F，而F整體保存效果要好于E。

2.1.2 不同稀釋液中羊精子的存活時(shí)間及存活指數(shù) 由表3可知，在4 ℃保存條件下，6種稀釋液中的精子總存活時(shí)間、有效存活時(shí)間和生存指數(shù)存在差異，F(xiàn)稀釋液中精子的總存活時(shí)間和有效存活時(shí)間顯著或極顯著高于其他5種稀釋液（P<0.05或P<0.01），且生存指數(shù)也極顯著高于其稀釋液（P<0.01），F(xiàn)稀釋液對(duì)精子4 ℃保存效果最好。

2.2 冷凍保護(hù)劑對(duì)湖羊精液冷凍保存效果的影響

2.2.1 不同種類(lèi)及添加比例冷凍保護(hù)劑對(duì)湖羊冷凍精液精子活率的影響 由表4可知，將細(xì)管凍精解凍后，通過(guò)鏡檢初步檢測(cè)解凍后0 h精子活率，結(jié)果表明不同冷凍保護(hù)劑對(duì)精子的冷凍保存效果存在差異，以乙二醇及丙三醇的冷凍保存效果最佳，湖羊凍精解凍活率保持在0.5左右，且不同濃度的冷凍保護(hù)劑對(duì)精子的冷凍保存效果也不同，甲醇、二甲基亞砜、乙二醇乙醚的添加濃度以10%為最佳，乙二醇、丙三醇、1，2-丙二醇以5%為最佳。

2.2.2 流式細(xì)胞儀活率檢測(cè) 通過(guò)常規(guī)活率檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)5%乙二醇和5%丙三醇對(duì)精子的冷凍保存效果較好。由圖2可知，通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)5%乙二醇和5%丙三醇的冷凍保存效果做進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)精子解凍活率要略高于5%乙二醇，這與前期的鏡檢結(jié)果基本一致。所以丙三醇為本試驗(yàn)的最佳冷凍保護(hù)劑，5%為最佳添加濃度。

3 討論

本研究對(duì)比了6種稀釋液對(duì)湖羊精子的4 ℃保存效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)稀釋液的保存效果最佳，在6 d仍可保持60%以上的精子存活率，說(shuō)明F稀釋液為湖羊精子提供了較好的營(yíng)養(yǎng)及緩沖。遲慶德等曾利用優(yōu)秀稀釋液對(duì)綿羊精液進(jìn)行稀釋輸精，取得非常理想的情期受胎率[5-7]，本項(xiàng)目組在后續(xù)的研究中也將會(huì)開(kāi)展輸精試驗(yàn)，并進(jìn)一步優(yōu)化稀釋液配方，為湖羊的鮮精保存及異地輸精提供保障。

本研究對(duì)比了6種滲透性抗冷凍保護(hù)劑對(duì)湖羊精子的冷凍保護(hù)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙二醇和丙三醇的保護(hù)效果較好，且丙三醇更佳，這與劉玉峰等的研究結(jié)果[8]基本一致。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，丙三醇低溫冷凍保護(hù)性能，可能與丙三醇能濃縮或結(jié)合細(xì)胞內(nèi)水，并具有阻礙冰晶核形成和增長(zhǎng)的性能及制菌作用有關(guān);而乙二醇的低溫冷凍保護(hù)性能則可能是由于乙二醇分子量小，滲入或滲出細(xì)胞的速率與水分子差異不大，對(duì)精細(xì)胞的滲透壓影響較小[9]。同時(shí)，本研究還對(duì)6種冷凍保護(hù)劑的3種添加濃度進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同冷凍保護(hù)劑的最佳添加濃度不一致，如乙二醇甲醚、甲醇的添加濃度以10%為最佳，而丙三醇、乙二醇的添加比例以5%最佳，這可能是因?yàn)椴煌鋬霰Ｗo(hù)劑對(duì)精子的活力和受精力普通存在毒害作用，如甘油能引起精子頂體的異常，而乙二醇則可以引起尾部畸形[10]，冷凍保護(hù)劑添加比例過(guò)高或過(guò)低對(duì)精子的毒害作用更顯著。

另外，本研究采用常規(guī)鏡檢和流式細(xì)胞儀檢測(cè)2種方法，對(duì)5%丙三醇和5%乙二醇的冷凍保存效果進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種方法檢測(cè)出的凍精解凍活率存在差異。這可能與常規(guī)鏡檢存在誤差有關(guān)，部分尾部畸形或頂體損傷的精子通過(guò)常規(guī)檢測(cè)無(wú)法判斷，計(jì)數(shù)時(shí)被統(tǒng)計(jì)為正常精子，而流式細(xì)胞儀是通過(guò)對(duì)染色后精子的熒光情況進(jìn)行篩選，相比較而言數(shù)據(jù)結(jié)果更為可靠。4 結(jié)論

本研究在比較了6種常用精液稀釋液的基礎(chǔ)上，篩選出更適合湖羊精液稀釋的F稀釋液（果糖、Tris和檸檬酸組合）;并以F稀釋液為基礎(chǔ)，比較了6種冷凍保護(hù)劑的3種濃度對(duì)湖羊精子凍存的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以5%的丙三醇作為冷凍保護(hù)劑的效果最佳，凍精活率達(dá)到了39.5%，可用于生產(chǎn)實(shí)踐，為后續(xù)凍精在湖羊生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

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收稿日期：2018-09-05

基金項(xiàng)目：浙江省農(nóng)業(yè)重大技術(shù)協(xié)同推廣計(jì)劃（編號(hào)：2019XTTGSG02）;浙江省湖州市農(nóng)業(yè)新品種選育及產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)專(zhuān)項(xiàng)主動(dòng)設(shè)計(jì)項(xiàng)目（編號(hào)：2015ZD2014）;浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院地方科技合作項(xiàng)目（編號(hào)：181022）。

作者簡(jiǎn)介：曹 訪（1980—），男，江蘇豐縣人，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種。E-mail：hzyzucf@hotmail.com。

通信作者：郭良勇，碩士，畜牧師，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種。E-mail：1728893756@qq.com。