尤海琳，姜 璐，劉鍇鍇，宮 璇，郭夢雪，迪力努爾·吐爾遜，胡建恩，盧 航

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023)

磷脂是一類廣泛存在于自然界中的含磷脂質(zhì)，是生物膜的重要組成部分，也是構(gòu)成生命的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[1]。因磷脂豐富的生理活性，使得其在食品、保健品、醫(yī)藥以及飼料行業(yè)中備受關(guān)注[2-3]。海洋磷脂是指來源于海洋生物的磷脂，其基本特征是Sn-2上的脂肪酸由多不飽和脂肪酸組成[4-6]，如二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)，因此表現(xiàn)出更為優(yōu)越的生理活性，比如更好的抗氧化性[7]、抗炎、降血脂、穩(wěn)定性等[8]，其營養(yǎng)價(jià)值引起人們極大關(guān)注[9-11]。

海膽性腺，俗稱海膽黃，是海膽中唯一可食用部分。目前，海膽的食用方式主要以鮮食為主，在市場上有兩種流通形式：一種為冰鮮水袋海膽，即將新鮮的海膽生殖腺置于鹽水水袋中，封口冰鮮保存；另一種為冰鮮擺盒海膽，即將鮮海膽生殖腺擺放在包裝盒中冰鮮保存。海膽性腺中脂質(zhì)含量豐富，約占濕重的4.43%[12]，主要由甘油三酯、磷脂及少量糖脂等物質(zhì)組成，其中脂肪酸多由多不飽和脂肪酸組成，如在紫海膽中檢出其含有30多種脂肪酸，其中ω-6系列不飽和脂肪酸∶ω-3系列不飽和脂肪酸的比值高達(dá)0.71[13]，因而海膽性腺具有較高的食用價(jià)值和藥用功能。然而，由于磷脂中多不飽和脂肪酸含量較高，易受溫度、酶、氧氣等因素的影響，因此在貯運(yùn)過程中極易發(fā)生氧化及水解，從而影響產(chǎn)品的品質(zhì)風(fēng)味及營養(yǎng)價(jià)值。目前，國內(nèi)外對(duì)海產(chǎn)磷脂的研究報(bào)道不多，王昕岑研究發(fā)現(xiàn)小黃魚肌肉、睪丸和肝臟中磷脂在4℃條件下貯存5 d后，其含量均呈現(xiàn)下降趨勢[14]；王曉旭等研究凡納濱對(duì)蝦磷脂水解機(jī)理發(fā)現(xiàn)，貯藏中卵磷脂變化主要是磷脂酶A2催化水解反應(yīng)，其水解產(chǎn)物主要為游離脂肪酸和溶血卵磷脂[15]；楊文鴿等研究發(fā)現(xiàn)馬面鲀卵巢中磷脂在不同溫度下貯藏3 d過程中，隨著溫度的升高磷脂酰膽堿所占的百分比快速下降，而溶血磷脂酰膽堿的比例有不同程度的增加[16]。因此本文以冰鮮擺盒海膽為原料，研究低溫貯藏過程中海膽性腺磷脂的變化，旨在為冰鮮海膽食用提供理論依據(jù)及參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黃海膽(Glyptocidariscrenularis)性腺，由大連戴氏生物科技有限公司提供，在4℃條件下貯存72 h，每12 h取樣一次，樣品凍干處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海膽性腺中總脂質(zhì)的提取

采用修改后的Floch法進(jìn)行總脂質(zhì)提取。海膽性腺凍干后勻漿液以1∶10(m/v)的比例與氯仿-甲醇(2∶1，v/v)溶液混合，攪拌后，靜置10 min抽濾，收集濾液，濾渣再次重復(fù)兩次上述操作。將上述所得濾液合并至分液漏斗中，加入1/5濾液體積的0.9% NaCl溶液，振蕩搖勻后靜置過夜分層，收集下層氯仿層，于45℃下真空旋蒸至干，氮?dú)獯蹈尚羝恐惺Ｓ嗨郑羝恐袣堄辔锛礊楹Ｄ懶韵倏傊|(zhì)。

1.2.2 海膽性腺脂質(zhì)分析

采用硅膠柱層析的方法[17-19]：100 g硅膠濕法裝柱，待柱子平衡過夜后，稱取上述提取的海膽性腺總脂質(zhì)約600 mg，用少量氯仿溶解后上樣，分別依次用5倍柱體積的氯仿洗脫中性脂肪，三倍柱體積丙酮洗脫糖脂和色素(脂溶性色素)，再用2.5倍柱體積甲醇將磷脂洗脫下來，分別收集后旋蒸至干并稱重，記錄各部分重量。將磷脂溶于氯仿中，放于-20℃冰箱中保存。

1.2.3 海膽性腺中磷脂的定性定量分析

采用高效液相色譜法搭配蒸發(fā)光檢測器(HPLC-ELSD)[3]，通過整體正相硅膠柱搭配正己烷-異丙醇-水體系，進(jìn)行海膽性腺中磷脂定性定量分析。

準(zhǔn)確稱取適量硅膠柱層析海膽性腺磷脂樣品，溶解于色譜級(jí)正己烷-異丙醇(3∶1，V∶V)混合液中，使用磁力攪拌器攪拌均勻。使用前用0.22 μm孔徑的有機(jī)相濾膜過濾除雜，放于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

使用日立LaChrom Elite系列高效液相色譜儀，搭配Alltech2000蒸發(fā)光散射檢測器，Chromolith?Performance-Si型德國默克正相硅膠色譜柱(100 mm×4.6 mm)。采用三元梯度方式進(jìn)行洗脫，其中流動(dòng)相A為正己烷+三乙胺；流動(dòng)相B為異丙醇(100%)；流動(dòng)相C為13%冰乙酸。流動(dòng)相的流速為1.5 mL/min，柱溫箱溫度為25℃。檢測器采用分流模式，以空氣作為霧化氣，空氣流速為1.7 L/min，漂移管溫度45℃[3]。高效液相梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫流動(dòng)相組成

注：a正己烷(含0.04%三乙胺)，b異丙醇(100%)，c13%乙酸。

Notes：aN-hexane(containing 0.04% triethylamine)，b2-propanol(100%)，c13% acetic acid glacial.

1.2.4 海膽性腺磷脂中脂肪酸的分析

使用島津氣相色譜儀對(duì)海膽性腺中磷脂進(jìn)行脂肪酸分析。測定前先對(duì)樣品進(jìn)行甲酯化處理：準(zhǔn)確稱取10.0 mg的海膽磷脂樣品，加入2 mL2% H2SO4/甲醇溶液，樣品管中充入氮?dú)?，?0℃水浴加熱1 h后取出，再依次加入1 mL蒸餾水和1 mL正己烷，渦旋震蕩。靜置分層后取上層正己烷氮?dú)獯蹈?，溶?00 μL正己烷中，使用前用0.22 μm孔徑有機(jī)相濾膜過濾除雜。

采用FFAP柱(30 m×0.32 mm i.d.)為分析柱；進(jìn)樣口溫度250℃，檢測器溫度260℃；采用程序升溫方式，首先在50℃下保留1 min，以15℃/min升到100℃，再以5℃/min升到120℃，然后25℃/min升高到200℃保留6 min，最后3℃/min升高到220℃保留10 min，載氣為高純氮?dú)猓M(jìn)樣量1.0 μL。通過比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖保留時(shí)間，確定脂肪酸甲酯的成分，對(duì)全部峰面積積分后利用面積歸一化法得到各主要脂肪酸的相對(duì)百分組成。

2 結(jié)果與討論

2.1 海膽性腺脂質(zhì)在貯藏過程中的變化

通過柱層析分析海膽性腺脂質(zhì)組成，結(jié)果如表2。

表2 海膽性腺貯藏過程中脂質(zhì)組成變化

由表2可以看出，海膽性腺油脂中主要由中性脂肪(50%)、磷脂組成(46%)、糖脂+色素(7%)組成；隨著貯藏時(shí)間延長，油脂中中性脂肪含量從50%上升至62%；糖脂+色素(脂溶性色素)含量升高至17%，其含量升高推測是因?yàn)橘A存過程中一些與蛋白質(zhì)結(jié)合的脂溶性色素氧化水解出來使其含量增多[17]；因磷脂脂肪酸側(cè)鏈多由多不飽和脂肪酸組成，在貯存過程中極易發(fā)生氧化水解反應(yīng)，使得磷脂含量不斷下降，本實(shí)驗(yàn)中磷脂在72 h貯存中含量從46%降低到29%，說明海膽性腺中磷脂在貯藏過程中發(fā)生降解。因本實(shí)驗(yàn)采用硅膠柱層析法分析海膽性腺脂質(zhì)組成，在旋干過程中存在有機(jī)試劑殘留，使其脂質(zhì)含量總和升高，存在實(shí)驗(yàn)誤差。

2.2 海膽性腺磷脂在貯藏過程中的變化

2.2.1 磷脂測定方法建立

因在海洋磷脂中腦磷脂(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、鞘磷脂(SM)、卵磷脂(PC)、溶血卵磷脂(LPC)是含量較多的五種磷脂標(biāo)準(zhǔn)品，所以將其混合進(jìn)樣，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，采用HPLC-ELSD方法，五種磷脂標(biāo)準(zhǔn)品均能達(dá)到基線分離，且峰形良好，成單峰，每次分析均能在15 min內(nèi)完成，平衡9 min后進(jìn)下一個(gè)樣品。進(jìn)而以磷脂濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，配制不同濃度梯度的磷脂標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表3。

表3 磷脂標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

從表3可以看出ELSD的響應(yīng)值與磷脂濃度線性相關(guān)，進(jìn)而在此基礎(chǔ)上作為磷脂定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)海膽性腺中各類磷脂進(jìn)行定量分析。

2.2.2 海膽性腺磷脂貯藏過程中的變化

通過測定發(fā)現(xiàn)海膽性腺磷脂中主要含有PE、PI、PC三種磷脂，未檢測到SM的存在，其中PC含量最高，約占總磷脂的36%，其次是PE約占總磷脂的23%，而PI含量最少，在36 h時(shí)首次檢測到LPC的存在，在72 h時(shí)其含量增加到0.54%。從圖2～5可以看出，海膽性腺磷脂中，PE、PI隨著貯存時(shí)間延長呈現(xiàn)下降趨勢，說明其在貯存過程中發(fā)生了降解反應(yīng)；而PC含量先降后升，推測在存貯前期PC發(fā)生降解，而在貯藏后期一些結(jié)合態(tài)PC水解下來，引起PC提取率上升；在36 h時(shí)首次檢測到了LPC的存在，推測源于PC發(fā)生水解生成。

2.3 海膽性腺磷脂脂肪酸貯藏過程中的變化

黃業(yè)傳等在研究豬肉加工制品冷藏中脂肪酸組成的變化中發(fā)現(xiàn)，在冷藏中甘油三酯的脂肪酸組成基本不變，磷脂中多不飽和脂肪酸的比例顯著減少，而飽和單不飽和脂肪酸的比例顯著增加[20]。從表4可以看出，海膽性腺磷脂中含有20余種脂肪酸，且多由多不飽和脂肪酸組成，主要

由C20∶4n6、C16∶0、C20∶5n3、C20∶2組成，其中C20∶5n3(EPA)所占比例高達(dá)24.99%，在貯存72 h過程中，其含量逐漸降低至23.90%；而C20∶4n6在貯存過程中其含量從18.21%降低至16.20%；在低溫貯藏過程中多不飽和脂肪酸含量從60.72%降低至55.70%，磷脂不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸從5.33%逐漸降低至4.33%。本結(jié)果與黃業(yè)傳等研究結(jié)果[20]一致，說明海膽性腺磷脂脂肪酸在貯運(yùn)過程中發(fā)生了氧化降解反應(yīng)。

表4 海膽性腺中磷脂脂肪酸組成

續(xù)表4

3 結(jié)論

本研究采用HPLC-ELSD方法對(duì)海膽性腺中磷脂種類和含量進(jìn)行定性、定量分析，得出海膽性腺中腦磷脂(PE)、卵磷脂(PC)、磷脂酰肌醇(PI)三種磷脂含量豐富，未檢測到鞘磷脂(SM)的存在，4℃貯藏72 h的過程中，PE、PI含量逐漸降低，PC含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，而在48 h后海膽性腺磷脂中首次出現(xiàn)了溶血卵磷脂(LPC)，推測是因?yàn)镻C發(fā)生降解反應(yīng)生成了LPC。通過氣相色譜測定發(fā)現(xiàn)磷脂中含有20余種脂肪酸，在貯藏過程中不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸從5.33%逐漸降低至4.33%，說明磷脂脂肪酸發(fā)生了氧化反應(yīng)。通過本研究證明了海膽性腺中的磷脂在4℃貯藏期間發(fā)生了氧化水解反應(yīng)，初步總結(jié)了冷藏過程中海膽性腺中磷脂的變化規(guī)律，為海膽性腺貯藏運(yùn)輸過程中品質(zhì)的變化提供理論依據(jù)。