王麗，呂紀華，劉瑛，饒偉源，鄧聿胤，覃良

(廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西中藥質量標準研究重點實驗室，廣西 南寧 530022)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫疾病[1]，以關節(jié)和關節(jié)周圍組織的非感染炎癥為主要病變，好發(fā)于中年女性[2]，其機制錯綜復雜，其中T細胞介導的自身免疫異常在疾病進展過程中至關重要。透骨香為夾竹桃科植物筋藤(AlyxialevineiMerr.)的干燥根和莖[3]，是廣西民間常用壯藥，具有祛風除濕，消腫止痛的功效，用于治療類風濕關節(jié)炎之關節(jié)疼痛，療效甚佳，但其藥物活性及作用機制研究未見任何報道。本研究采用T淋巴細胞體外增殖實驗對透骨香抗RA作用的活性部位進行篩選，并初步探討其作用機制，為透骨香治療類風濕關節(jié)炎提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物 BALB/c小鼠，雄性，體重14～16 g，SPF級，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2013-0002。

1.2 藥物 透骨香藥材采自廣西玉林市，經(jīng)本研究院饒偉源主任藥師鑒定為夾竹桃科植物筋藤(AlyxialevineiMerr.)后使用。透骨香藥材8 kg采用60%乙醇加熱回流提取，提取液回收乙醇后，藥液分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行梯度提取分離，得到正丁醇部位25.1 g(提取率0.31%)、乙酸乙酯部位5.39 g(提取率0.07%)、石油醚部位0.40 g(提取率0.005%)和水溶部位364.3 g(提取率4.55%)共4 個部分，石油醚、乙酸乙酯及正丁醇部位用二甲基亞砜(DMSO)溶解成10 mg·mL-1儲備液，水溶部位用RPMI-1640培養(yǎng)基溶解成10 mg·mL-1儲備液，過濾除菌，實驗時分別以RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋使用。

1.3 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone公司)；小鼠脾臟淋巴細胞分離液試劑盒、青鏈霉素混合液(Solarbio公司)；細胞計數(shù)試劑盒8[CCK-8,東仁化學科技(上海)有限公司]；酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒(天津安諾瑞康生物技術有限公司)；刀豆蛋白A(CoA，Sigma公司)，實驗時以RPMI-1640培養(yǎng)基配制成所需濃度。

1.4 主要儀器 H1850臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；Multiskan Go全波長全自動多功能酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司)；MCO-18AIC二氧化碳培養(yǎng)箱(Panasonic 公司)。

1.5 實驗方法

1.5.1 脾淋巴細胞的制備 取8只BALB/c小鼠，處死后用75%乙醇溶液浸泡10 min，生物安全柜內無菌條件下摘取脾臟，撕去脾臟包膜，用眼科剪剪成小塊放置200目細胞篩網(wǎng)上，細胞篩網(wǎng)置于平皿(加入少量全血及組織稀釋液)中，使用注射器活塞研磨脾臟，研磨完全后使用全血及組織稀釋液沖洗篩網(wǎng)，收集細胞懸液后再經(jīng)濾網(wǎng)過濾，獲得脾臟單細胞懸液。取離心管，小心吸取單細胞懸液加于等量分離液液面上，保持兩液面界面清晰，室溫下，800 g離心20 min，離心后吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細胞至離心管中，加入細胞洗滌液洗滌白膜層細胞，250 g離心10 min，棄上清，5 mL細胞清洗液洗滌細胞2次(250 g離心10 min)，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，青鏈霉素100 U·mL-1)重懸細胞，制備成脾淋巴細胞懸液。

1.5.2 透骨香各部位對CoA刺激的T淋巴細胞增殖的影響 將脾淋巴細胞懸液調整為細胞密度1.0×106/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL細胞懸液，實驗分組處理如下：各部位藥物組：每孔加入 50 μL CoA(終濃度為5 μg·mL-1)+50 μL藥物(終濃度分別為5、2.5、1 μg·mL-1)；CoA組：每孔加入50 μL CoA(終濃度為5 μg·mL-1)+50 μL RPMI-1640培養(yǎng)基；陰性對照組：每孔加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基；溶劑對照組：每孔加入50 μL CoA(終濃度為5 μg·mL-1)+50 μL DMSO溶液(終體積分數(shù)0.05%)。每組均設4個復孔。將96孔板置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標儀450 nm檢測光密度(OD)值，計算淋巴細胞刺激指數(shù)(SI)。SI=實驗組OD/陰性對照組OD。

1.5.3 透骨香水溶部位對細胞因子白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-10(IL-10)的影響 將脾淋巴細胞懸液調整為細胞密度1.0×106/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL細胞懸液，實驗分組處理如下：透骨香水溶部位組：每孔加入50 μL CoA(終濃度為5 μg·mL-1)+50 μL藥物(終濃度分別為5、2.5、1、0.5 μg·mL-1)；CoA組：每孔加入50 mL CoA(終濃度為5 μg·mL-1)+50 μL RPMI-1640培養(yǎng)基；陰性對照組：每孔加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基。每組均設6個復孔，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集細胞上清液，嚴格按照試劑盒要求采用ELISA法檢測細胞因子IL-2、IL-10的含量。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 透骨香各部位對CoA刺激的脾淋巴細胞增殖的影響 與陰性對照組比較，CoA組OD值顯著升高(P<0.05)，刺激指數(shù)明顯升高，提示CoA刺激脾淋巴細胞增殖作用顯著；與CoA組比較，透骨香正丁醇部位(2.5 μg·mL-1)及水溶部位(5、2.5、1 μg·mL-1)組OD值顯著降低(P<0.05)，刺激指數(shù)明顯降低，其中水溶部位(5 μg·mL-1)作用最強，其余部位組及DMSO溶劑對照組均無明顯差異(P>0.05)，提示透骨香水溶部位具有較強抑制脾淋巴細胞增殖的作用，結果見圖1、表1。

圖1 透骨香各部位對CoA刺激的脾淋巴細胞增殖的影響

組別劑量/μg·mL-1刺激指數(shù)陰性對照組-1CoA組-1.43151.428CoA+正丁醇部位2.51.30411.44351.465CoA+乙酸乙酯部位2.51.47011.41850.624CoA+水溶部位2.50.99211.358CoA+石油醚部位51.4072.51.40511.401

2.2 透骨香水溶部位對細胞因子的影響 與陰性對照組比較，CoA組IL-2、IL-10含量均顯著升高(P<0.05)，提示CoA刺激脾淋巴細胞增殖后細胞因子分泌顯著增強；與CoA組比較，透骨香水溶部位組(5、2.5、1 μg·mL-1)IL-2含量顯著降低(P<0.05)，IL-10含量顯著升高(P<0.05)，提示透骨香水溶部位對CoA刺激小鼠脾淋巴細胞分泌的細胞因子IL-2具有抑制作用，對細胞因子IL-10具有促進作用，結果見圖2～3。

圖2 透骨香水溶部位對CoA刺激的脾淋巴細胞分泌IL-2含量的影響

圖3 透骨香水溶部位對CoA刺激的脾淋巴細胞分泌IL-10含量的影響

3 討論

壯醫(yī)藥是我國中醫(yī)藥和民族傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分，RA屬于中醫(yī)“痹證”范疇、壯醫(yī)的“發(fā)旺”范疇。壯醫(yī)認為，病人多處潮濕之地，濕阻脈絡，繼而入骨，病久正氣虛衰，氣血不足，肝腎虛虧，氣滯血瘀，虛實夾雜，正氣損傷，濕滯黏膩，不易自散，故病情遷延難愈。治療當以祛風除濕，消腫止痛，益氣活血通絡[4-6]。壯藥透骨香為夾竹桃科植物筋藤(AlyxialevineiMerr.)的干燥根和莖，又名三托藤、九牛藤、坎香藤，主產(chǎn)于廣西和廣東，為廣西民間常用草藥，是民族藥“五松腫痛酊”中的原料藥材，具有祛風除濕，消腫止痛，祛腐生肌之功效，用于治療類風濕關節(jié)炎引起的風濕痹痛、關節(jié)腫痛，效果甚佳。

RA是一種自身免疫性疾病，其中T淋巴細胞免疫功能異常是其發(fā)病的主要機制之一。研究證實，RA患者滑膜組織內存在T淋巴細胞的異常增殖和活化， T淋巴細胞活化后可調控巨噬細胞、B細胞、滑膜細胞、樹突狀細胞等功能，引起一系列免疫炎癥反應，釋放大量細胞因子、抗體及酶類，浸潤滑膜組織，導致滑膜組織炎癥和增生從而引起關節(jié)損傷[7]。脾臟中含有大量的T淋巴細胞，絲裂原ConA能夠刺激T淋巴細胞活化增殖，促進其分泌細胞因子及表達受體[8]，因此體外T淋巴細胞增殖實驗能夠模擬RA免疫功能異常狀態(tài)進行藥物篩選實驗。本研究結果顯示，透骨香藥物4個部位中，正丁醇部位及水溶部位能夠明顯降低ConA誘導的T淋巴細胞刺激指數(shù)，其中水溶部位(5 μg·mL-1)作用最強，提示透骨香水溶部位具有較強抑制T淋巴細胞增殖作用。

RA患者發(fā)病過程中，體內存在著T淋巴細胞亞群比例失衡，輔助性T細胞(Th)中Th1/Th2平衡紊亂，出現(xiàn)Th1極化和Th2分化阻礙[9]，引起細胞因子網(wǎng)絡失調，滑膜細胞、淋巴細胞會產(chǎn)生大量炎癥細胞因子，參與炎癥遷延和關節(jié)損傷，其中細胞因子IL-2和IL-10發(fā)揮重要作用。IL-2主要由Th1細胞分泌，又稱為T 細胞生長因子，可以與T 淋巴細胞表面的IL-2R結合激活T細胞，促進T細胞的活化與增殖，具有免疫增強和免疫調節(jié)的作用，研究表明，活動性RA患者血清中IL-2水平明顯升高[10-11]。IL-10主要由Th2細胞分泌，是一種負性免疫調節(jié)因子，可以通過降低單核細胞抗原提呈能力，阻止抗原特異性T細胞增殖，減少單核細胞、中性粒細胞等產(chǎn)生促炎癥細胞因子和趨化因子，抑制炎癥反應[12-13]。本研究結果顯示，透骨香水溶部位作用于ConA誘導的T淋巴細胞后，細胞因子IL-2含量顯著降低，IL-10含量顯著升高，提示透骨香水溶部位能夠通過抑制T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2，促進IL-10的生成，從而在RA中發(fā)揮免疫調節(jié)作用。

綜上所述，本研究對壯藥透骨香抗RA活性部位進行了篩選研究，明確了透骨香水溶部位對T淋巴細胞增殖具有較強抑制作用，是透骨香抗RA活性部位，其機制可能與調節(jié)細胞因子IL-2、IL-10分泌有關，為透骨香臨床用于治療RA提供了理論依據(jù)。但本研究僅限于藥物部位篩選，透骨香藥物化學成分及作用機制有待進一步深入研究。