孫小萌，筆雪艷，曲范娜，李再紅，朱勝男，徐兵

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省食品藥品檢驗(yàn)檢測所，黑龍江 哈爾濱 150001；3.吉林恒金藥業(yè)股份有限公司，吉林 梅河口 135100)

養(yǎng)陰鎮(zhèn)靜丸由當(dāng)歸、麥冬、五味子、首烏藤、生地黃、茯苓、柏子仁、黨參、珍珠母、玄參、丹參、遠(yuǎn)志、桔梗、朱砂14味藥組成。該品種原標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第十九冊， WS3-B-3615-98是原標(biāo)準(zhǔn)號。原標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容只包括性狀、當(dāng)歸和丹參的薄層色譜鑒別及檢查項(xiàng)。為了提高標(biāo)準(zhǔn)的可控性及可操作性，對該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了完善和提高。對原標(biāo)準(zhǔn)中的當(dāng)歸和丹參薄層鑒別做了方法學(xué)驗(yàn)證。因當(dāng)歸和遠(yuǎn)志鑒別陰性干擾，最后刪除了當(dāng)歸的薄層鑒別，研究建立了五味子、珍珠母、茯苓、和朱砂的顯微鑒別，增加了五味子醇甲的含量測定方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，表明該測定方法準(zhǔn)確可行。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Thermofisher U3000高效液相色譜儀， DAD檢測器；Nikon 50i熒光顯微鏡；AE-240電子天平；DK-98-1型雙列六孔水浴鍋。色譜柱：Techmate C18-ST(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

1.2 試藥 五味子醇甲(中國藥品與生物制品檢定所，批號110857-201412)；乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 顯微鑒別

原標(biāo)準(zhǔn)中，沒有顯微鑒別項(xiàng)。通過對3批成品進(jìn)行顯微觀察，增加了五味子、珍珠母、朱砂和茯苓的顯微鑒別。五味子[1]鑒別特征為種皮表皮石細(xì)胞表面觀呈多角形或長多角形，直徑1850 μm，壁厚，孔溝極細(xì)密，胞腔內(nèi)含深棕色物(見圖1)。珍珠母[1]鑒別特征為不規(guī)則碎塊表面多不平整，呈明顯的顆粒性，有的呈層狀結(jié)構(gòu)，邊緣多數(shù)為不規(guī)則鋸齒狀(見圖2)。朱砂[1]的鑒別特征為不規(guī)則細(xì)小顆粒暗棕紅色，有光澤，邊緣暗黑色(見圖3)。茯苓[1]的鑒別特征為不規(guī)則分枝狀團(tuán)塊無色，遇水合氯醛試液融化(見圖4)；菌絲無色或淡棕色(見圖5)。

圖1 五味子石細(xì)胞顯微鑒別(×40)

圖2 珍珠母顯微鑒別(×40)

圖3 朱砂的顯微鑒別(×40)

圖4 茯苓團(tuán)塊的顯微鑒別(×40)

圖5 茯苓菌絲的顯微鑒別(×40)

3 五味子醇甲的含量測定

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱為Techmate C18-ST(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A為乙腈，B為水，進(jìn)行梯度洗脫(梯度見表1)；檢測波長為217 nm。流量為1 mL·min-1;理論板數(shù)按五味子醇甲峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

表1 梯度洗脫條件

3.2 對照品溶液的制備[2]取五味子醇甲對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含五味子醇甲10 μg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備[3-4]取重量差異項(xiàng)下的本品1丸，剪碎，加等量硅藻土，研勻，取約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 陰性對照溶液 按比例取五味子以外的處方藥適量，按制法制成五味子的陰性對照樣品，取相當(dāng)于0.5 g的量，加甲醇溶液，按上述供試品溶液制備方法制備陰性對照液。

3.5 線性關(guān)系考察[5]取五味子醇甲對照品，經(jīng)精密稀釋濃度補(bǔ)差29.13、19.42、9.71、4.86、0.97 μg·mL-1，制備5個(gè)濃度的對照品溶液，進(jìn)樣量均為10 μL，按含量測定方法測定峰面積，橫坐標(biāo)是對照品樣品量，縱坐標(biāo)為峰面積的積分值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，回歸方程為：Y=737.800 0X-0.018 8，r=1.000 0，五味子醇甲在0.97～29.13 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.6 精密度試驗(yàn) 吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，依法測定五味子醇甲的峰面積，結(jié)果五味子醇甲的峰面積RSD值為0.1%，說明儀器精密度良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品(批號：20180403)，分別在制備后0、2、4、6、8、10、16、24 h測定五味子醇甲的峰面積,結(jié)果24 h內(nèi)五味子醇甲的峰面積的RSD為0.2 %，證明供試品制備后24 h內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取批號為20180403的樣品6份，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照上述方法測定，按外標(biāo)法計(jì)算供試品中五味子醇甲的含量。結(jié)果五味子醇甲的平均含量為0.199 8 mg·g-1,樣品的RSD值為1.7%，重復(fù)性結(jié)果良好。

3.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品(批號20180403)6份，每份約1.5 g。精密稱定，6份樣品中各精密加入對照品溶液25 mL(濃度=0.005 826 mg·mL-1，相當(dāng)于對照品0.145 7 mg)。按“3.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，并測定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。本檢測方法具有較好的回收率。

回收率=(加標(biāo)樣品測得量-樣品含量)/加對照品量×100%

表2 回收率測定結(jié)果

3.10 專屬性試驗(yàn) 取對照品溶液，供試品溶液，及陰性對照溶液，按上述色譜法測定。結(jié)果供試品色譜中呈現(xiàn)與對照品色譜峰保留時(shí)間相應(yīng)的色譜峰，結(jié)果表明處方中除五味子外的其他藥味對五味子醇甲的測定無干擾。色譜圖見圖6。

A對照品；B供試品；C陰性對照 1五味子醇甲圖6 專屬性試驗(yàn)HPLC色譜圖

3.11 含量測定與限度的確定 按上述色譜條件和樣品制備方法，測定了10批樣品中五味子醇甲的含量，結(jié)果見表3。暫定含量測定限度為10批樣品含量測定平均值的80%為最低含量，既每丸含五味子以五味子醇甲計(jì)，不得少于1.35 mg。在養(yǎng)陰鎮(zhèn)靜丸中，五味子粉碎后直接制丸，《中國藥典》2015年版(一部)中對五味子藥材中五味子醇甲含量限度的要求為不得少于0.4%。養(yǎng)陰鎮(zhèn)靜丸的限度相當(dāng)于五味子中含五味子醇甲應(yīng)不得少于0.43%，更加嚴(yán)格的控制了產(chǎn)品的質(zhì)量。

表3 10批養(yǎng)陰鎮(zhèn)靜丸中五味子醇甲的含量

3.12 范圍 取批號為20180403的樣品，根據(jù)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的要求，參照相關(guān)資料，對本制劑所規(guī)定的含量限度的50%與150%進(jìn)行范圍測定，分別測定3組數(shù)據(jù)，將此6組數(shù)據(jù)與樣品測定的3組數(shù)據(jù)進(jìn)行RSD的計(jì)算，結(jié)果RSD小于2.0%，見表4。表明在此范圍內(nèi)，含量測定方法較為準(zhǔn)確。

表4 養(yǎng)陰鎮(zhèn)靜丸的范圍測定結(jié)果

4 討論

4.1 檢測波長的選擇[6]取五味子醇甲對照品適量，制成每1 mL含40 μg的溶液,設(shè)置DAD檢測器在190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描，結(jié)果顯示五味子醇甲溶液在217 nm處有最大吸收，故選擇217 nm作為測定波長。

4.2 提取溶劑的選擇[7]根據(jù)五味子醇甲自身溶解性特點(diǎn)，考察了甲醇和乙醇兩種提取試劑制備供試品溶液，依法測定五味子醇甲的含量。結(jié)果顯示甲醇的提取效率明顯高于乙醇，故選擇甲醇為提取溶劑。

4.3 提取方法的選擇[8]考察了4種提取方式，分別為超聲30 min，超聲1 h，加熱回流30 min，加熱回流1 h。測定結(jié)果顯示4種提取方法的并無明顯差異。故選擇超聲30 min作為提取方法。