楊東升，李 靜，蘇 敏，李佳偉

（海南大學(xué)材料與化工學(xué)院生物工程系，海南?？?70228）

眾所周之，啤酒的風(fēng)味和香氣對(duì)決定其質(zhì)量至關(guān)重要，同時(shí)這些參數(shù)受到二氧化碳?jí)毫Φ挠绊慬1-2]。一般認(rèn)為，影響風(fēng)味化合物產(chǎn)生的最直接因素是溶解二氧化碳，其濃度取決于所施加的溫度和背壓。另一方面，隨著市場(chǎng)需求的增加，啤酒廠不斷增大啤酒生產(chǎn)的反應(yīng)器尺寸。巨大的發(fā)酵罐自然產(chǎn)生更高的靜水壓力，通常會(huì)增加溶解在啤酒中的二氧化碳濃度。在許多生物體中，包括酵母菌，高二氧化碳分壓對(duì)其生長(zhǎng)有抑制作用[3-4]。啤酒中所有風(fēng)味活性成分都是由酵母產(chǎn)生的，這些化合物最終將決定啤酒的最終質(zhì)量[5]。高級(jí)醇、酯類、乙醛、二甲基硫醚（DMS）和二氧化硫等是啤酒風(fēng)味的關(guān)鍵元素。

啤酒酵母產(chǎn)生的高級(jí)醇是啤酒中最豐富的感官成分。高級(jí)醇的形成與酵母代謝氨基酸有關(guān)。這些化合物的產(chǎn)生可以通過(guò)兩個(gè)途徑發(fā)生。第一是埃利希提出的分解代謝途徑[6]，第二是氨基酸合成途徑[7]。正丙醇、異丁醇和異戊醇是啤酒中最重要的高級(jí)醇。異戊醇的氣味閾值范圍為25 mg/L，正丙醇為50 mg/L[8]。即使某些高級(jí)醇或酯的實(shí)際濃度低于它們的閾值，但其存在對(duì)于整體風(fēng)味分布也很重要[9]。啤酒中的高級(jí)醇既是風(fēng)味活性化合物，又是與?；o酶A衍生物反應(yīng)生成酯的底物。有眾多的因素影響高級(jí)醇的形成，其中有酵母菌種、發(fā)酵溫度、酵母接種量、麥汁組成、麥汁通氧等[10]。高級(jí)醇的形成不僅會(huì)隨著較低的接種溫度和發(fā)酵溫度而減少，也會(huì)隨著CO2壓力的作用而降低[7，11]。有研究表明，較高的溫度增加了發(fā)酵速率和高級(jí)醇的產(chǎn)率和最終濃度，而不依賴于施加的背壓。然而，高級(jí)醇的濃度取決于CO2濃度[1]。

揮發(fā)性酯類是啤酒中風(fēng)味物質(zhì)的最大組分。酯類在啤酒中含量?jī)H為痕量，但它們對(duì)風(fēng)味譜極為重要。啤酒中的揮發(fā)性酯類可分為乙酸酯類和中鏈脂肪酸（MCFA）乙酯兩大類。乙酸酯是啤酒的主要風(fēng)味成分，因?yàn)樗鼈兊臐舛冗h(yuǎn)高于其他揮發(fā)性酯[5]。啤酒中最重要的酯類是乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、乙酸異丁酯和乙酸苯酯。乙酸乙酯的形成不受氮源影響，使其成為濃度最高的酯[12]。酯類氣味閾值較低，乙酸異戊酯為0.2 mg/L，乙酸乙酯為15～20 mg/L[13-14]。酯在酵母中通過(guò)乙醇或高級(jí)醇、?；o酶A（主要是乙酰輔酶A）和酯合成酶的生化途徑合成。方差分析證實(shí)，溶解CO2濃度對(duì)最大生長(zhǎng)速率、最大和初始酯產(chǎn)率有顯著的負(fù)面影響，并且這種效應(yīng)比溫度效應(yīng)更明顯[1]。在正常的啤酒發(fā)酵中，發(fā)酵溫度越高，發(fā)酵副產(chǎn)物越多。一種補(bǔ)救辦法是采用CO2的發(fā)酵罐背壓。CO2壓力升高，導(dǎo)致高級(jí)醇和酯的濃度降低，而鄰位二酮和乙醛的含量增加[15]。最大的酵母生長(zhǎng)速率和酯產(chǎn)率與超過(guò)2 g/L溶解CO2濃度呈顯著負(fù)相關(guān)[1]。研究表明，凡是有利于酵母旺盛發(fā)酵的工藝條件，都有利于酯類的形成[16]，相反，酯和高級(jí)醇的形成隨著二氧化碳?jí)毫υ龃蠖鴾p少，卻主要是由于酵母生長(zhǎng)的減少。

然而，CO2對(duì)高級(jí)醇形成的影響比對(duì)酯形成的影響要小[3]。另一方面，酯類的產(chǎn)生與麥汁濃度有關(guān)，而高濃度麥汁中的酵母產(chǎn)生更多的乙酸酯類。這導(dǎo)致了啤酒風(fēng)味的不平衡，是由產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物的不成比例的水平引起的[17-18]。這也可稱之為醇酯比失衡，研究證明，通過(guò)發(fā)酵醇酯比的合理控制，可以有效地控制啤酒風(fēng)味質(zhì)量的一致性和均一性[19]。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：啤酒大麥、啤酒花購(gòu)自濟(jì)南雙麥有限公司；啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae NCYC 1108由海南大學(xué)生物綜合實(shí)驗(yàn)室保存。

試劑：正丙醇、異丁醇、異戊醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯，GR，阿拉丁試劑（上海）有限公司。

儀器設(shè)備：頂空氣相色譜HP6890N，細(xì)胞計(jì)數(shù)板。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

麥汁制備：分別取20 kg和25 kg大麥芽粉碎，入100 L糖化鍋，加水80 L，按45℃保溫15 min，52℃保溫20 min，63 ℃保溫30 min，72 ℃保溫20 min，再加熱至78℃進(jìn)行浸出糖化。麥汁過(guò)濾液合并加水55 L，二次過(guò)濾液（洗糟）煮沸70 min，煮沸10 min時(shí)和煮沸40 min時(shí)各加50 g酒花。冷卻，分別制得8 °P麥汁和12 °P麥汁各100 L[20]。

發(fā)酵條件：每個(gè)實(shí)驗(yàn)使用100 L的兩種濃度的麥芽汁（8°P和12°P），麥芽汁充氧直到接種前飽和。發(fā)酵罐的排氣閥在接種后關(guān)閉，以產(chǎn)生背壓。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，壓力傳感器控制背壓分別保持在0、0.05 MPa和0.15 MPa，發(fā)酵在10℃下進(jìn)行。每20 h取樣品，測(cè)定細(xì)胞數(shù)、麥汁密度和溶解CO2、總高級(jí)醇含量和總酯濃度。共測(cè)量10 d。

酵母活化：啤酒酵母菌株經(jīng)復(fù)蘇、瓊脂平板劃線挑取單菌落、接入20 mL麥汁培養(yǎng)基,25℃培養(yǎng)2 d。酵母加入裝有經(jīng)滅菌的1.5 L 8°P麥汁的3 L錐形燒瓶中，用濾膜密封燒瓶，20℃軌道振蕩擴(kuò)培3 d。接種前2 h發(fā)酵溫度降至10℃。

高級(jí)醇和酯的檢測(cè)：采用頂空氣相色譜HP6890N（FID檢測(cè)器）測(cè)定正丙醇、異丁醇、異戊醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯。采用毛細(xì)管HP-NIONAX柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm膜厚）和頂空采樣器HP7694E。實(shí)驗(yàn)條件如下：注入溫度為225℃；柱溫程序，在40℃下保持3 min，然后以5℃/min升溫到90℃；檢測(cè)器溫度，300℃；載氣，氮?dú)?；載氣流量，30 mL/min；氫氣流量，40 mL/min；空氣流量，400 mL/min；分流比，6∶1；樣品瓶平衡溫度50℃；平衡時(shí)間，30 min；循環(huán)溫度，60℃；傳輸線溫度，65℃。工作站軟件PG2070AA[21-22]。

使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)定細(xì)胞數(shù)；溶解的CO2使用電位滴定儀測(cè)定；麥芽汁濃度采用錘度法測(cè)定[20，23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2背壓對(duì)CO2濃度、酵母數(shù)量、總高級(jí)醇和酯的影響

發(fā)酵方法如1.2部分所述，CO2背壓對(duì)基本發(fā)酵特性的影響見(jiàn)圖1—圖8。結(jié)果表明，施加0.05 MPa和0.15 MPa的CO2背壓顯著減緩了酵母生長(zhǎng)，降低了總高級(jí)醇的最終濃度和總酯生成，增大了溶解CO2的最終濃度。麥汁濃度并未明顯影響CO2的增長(zhǎng)趨勢(shì)，這可能與CO2濃度達(dá)到飽和有關(guān)。主發(fā)酵前期，CO2壓抑制酵母生長(zhǎng)，生成CO2數(shù)量較少，主發(fā)酵后期，在發(fā)酵溫度一致的情況下，CO2積累達(dá)到一定水平，壓力越大，濃度越高（圖1）。

圖1 CO2濃度變化圖

在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)增大背壓來(lái)減少酵母細(xì)胞生長(zhǎng)。由圖2可見(jiàn)，在主發(fā)酵前期，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線只是依照背壓水平分組，麥汁濃度的影響不大。不僅最大細(xì)胞計(jì)數(shù)減少了45%，而且達(dá)到最大值的時(shí)間延長(zhǎng)了40～60 h（圖2），同一酵母，較低發(fā)酵溫度或較高CO2背壓可以控制最大酵母數(shù)量。在實(shí)際生產(chǎn)中，采用背壓工藝時(shí)可以選擇性狀優(yōu)良的酵母作為生產(chǎn)菌株，以消除CO2對(duì)其生長(zhǎng)代謝的影響。

圖2 酵母數(shù)量變化圖

研究表明，細(xì)胞數(shù)量的減少導(dǎo)致較低的醇和酯濃度降低[24]。類似地，隨著研究中細(xì)胞數(shù)量的減少，總醇含量和總酯含量下降。另一方面，總高級(jí)醇和總酯的最終水平不僅取決于CO2背壓，也取決于麥汁濃度。12°P麥汁中總高級(jí)醇和總酯含量高于8°P麥汁（圖1）。雖然目前8°P啤酒市場(chǎng)在美國(guó)市場(chǎng)占有率很高，但這種啤酒在歐洲市場(chǎng)仍然不被接受，因?yàn)榈【票徽J(rèn)為是清淡型的，主要是因?yàn)槿狈诟衃25]。

圖3顯示，在無(wú)背壓情況下，8°P和12°P麥汁中總高級(jí)醇含量均在75 h時(shí)達(dá)到最高值。在0.05 MPa和0.15 MPa背壓情況下，8°P麥汁中總高級(jí)醇含量均在120 h達(dá)到最高值，分別約為無(wú)背壓最高值的50%和45%，12°P麥汁中總高級(jí)醇含量均在200 h達(dá)到最高值，分別約為無(wú)背壓最高值的70%和60%。由此可見(jiàn)，麥汁濃度控制高級(jí)醇的累加效應(yīng)，CO2背壓控制總高級(jí)醇最終生成量，控制效果是非常明顯的。

圖3 總高級(jí)醇含量變化圖

主酵時(shí)常壓發(fā)酵，雙乙酰還原結(jié)束再升壓，乙醛含量較低，酯含量較高[26]。這是一種提高酯含量的工藝方案。而提早升壓，結(jié)果是相反的。

圖4顯示，在無(wú)背壓情況下，8°P和12°P麥汁中總酯含量均在100 h達(dá)到最高值。在0.05 MPa背壓情況下，8°P和12°P麥汁中總酯含量分別在160 h和180 h達(dá)到最高值，分別約為無(wú)背壓最高值的66%和70%，在0.15 MPa背壓情況下，8°P和12°P麥汁中總酯含量同時(shí)在200 h達(dá)到最高值，分別約為無(wú)背壓最高值的52%和50%，由此可見(jiàn)，麥汁濃度控制總酯的累加效應(yīng)，CO2背壓控制總酯最終生成量，控制效果比高級(jí)醇更明顯。

圖4 總酯含量變化圖

圖1—圖4表明，CO2背壓對(duì)溶解CO2、酵母數(shù)量、總高級(jí)醇和總酯含量有非常明顯的影響。這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果不同，該研究在發(fā)酵過(guò)程中采用16℃的溫度，筆者認(rèn)為，背壓或CO2濃度對(duì)CO2生產(chǎn)、高級(jí)醇生產(chǎn)和相關(guān)底物同化僅產(chǎn)生輕微影響[1]，即使最大值是由溫度或背壓控制的，對(duì)應(yīng)于最大產(chǎn)率的時(shí)間也依賴于溫度[1]。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了10℃的較低溫度，這可以部分解釋結(jié)果的差異，因?yàn)楸娝苤?，在較低的溫度下，在相同的背壓下，麥芽汁中會(huì)產(chǎn)生更多的溶解CO2。溶解CO2的增加，降低了最大生長(zhǎng)速率、總高級(jí)醇產(chǎn)率和總酯產(chǎn)率[1]。

2.2 CO2背壓對(duì)CO2溶解速率、酵母生長(zhǎng)速率、高級(jí)醇和酯生成速率的峰值延遲和削減作用

圖1—圖4表明，總高級(jí)醇和總酯含量的峰值被顯著增加的背壓延遲，而且背壓對(duì)延遲總酯形成的影響大于總高級(jí)醇。我們知道，總高級(jí)醇含量和總酯含量峰值與酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)被抑制相關(guān)[15]。因此，進(jìn)一步研究風(fēng)味代謝物的生成速率的變化規(guī)律十分必要。由CO2背壓引起的一系列生長(zhǎng)代謝延遲及其關(guān)系見(jiàn)圖5—圖8。

如圖5所示，在未形成背壓的發(fā)酵系統(tǒng)中，CO2溶解速率只在60 h處出現(xiàn)一個(gè)峰值。此時(shí)就是啤酒發(fā)酵的高泡期，在敞口發(fā)酵系統(tǒng)中，溫度決定了高泡期出現(xiàn)和延續(xù)的時(shí)間。在背壓0.05 MPa的條件下，CO2溶解速率峰值明顯被延遲至80 h，在背壓0.15 MPa的條件下，CO2溶解速率峰值延遲至120 h。CO2溶解速率延遲意味著酵母細(xì)胞生長(zhǎng)代謝受到抑制。在背壓0.05 MPa的條件下，CO2溶解速率峰值明顯高于無(wú)背壓發(fā)酵和0.15 MPa背壓發(fā)酵，是否與較低壓或適當(dāng)CO2濃度對(duì)酵母的生長(zhǎng)代謝有刺激作用有關(guān)。

圖5 CO2溶解速率變化圖

酵母生長(zhǎng)速率對(duì)應(yīng)0、0.05 MPa、0.15 MPa背壓分別在60 h、80 h、120 h出現(xiàn)峰值，與CO2溶解速率延遲時(shí)間高度一致。酵母生長(zhǎng)伴生大量CO2，通過(guò)測(cè)量CO2的生成量可以衡量酵母發(fā)酵活性。無(wú)背壓發(fā)酵，酵母產(chǎn)生的大量CO2排出發(fā)酵系統(tǒng)，可以充分解除CO2的抑制作用，形成較大峰值（圖6）。CO2的延遲與抑制作用似乎與麥汁濃度無(wú)相關(guān)性，背壓越高，對(duì)峰值的削減越明顯。

高級(jí)醇是酵母主要代謝產(chǎn)物，同樣對(duì)應(yīng)0、0.05 MPa、0.15 MPa背壓分別在60 h、80 h、120 h出現(xiàn)峰值，與CO2溶解速率和酵母生長(zhǎng)速率延遲時(shí)間一致（圖7）。高級(jí)醇生成的峰值受到背壓影響延遲與削減同樣解釋了酵母生長(zhǎng)受到抑制。無(wú)背壓系統(tǒng)中高級(jí)醇的生成量是最大的（圖3）。當(dāng)然，麥汁濃度與高級(jí)醇生成量和生成速率正相關(guān)，高濃麥汁在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)高濃度高級(jí)醇的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象可能通過(guò)背壓調(diào)節(jié)進(jìn)行調(diào)控。施以背壓后，總高級(jí)醇生成速率峰值明顯下降（圖7），意味著生成趨勢(shì)變緩。

圖6 酵母生長(zhǎng)速率變化圖

圖7 總高級(jí)醇生成速率變化圖

酯類是酵母發(fā)酵另一類主要風(fēng)味代謝產(chǎn)物，對(duì)應(yīng) 0、0.05 MPa、0.15 MPa背壓分別在 80 h、120 h、200 h出現(xiàn)峰值，按無(wú)背壓發(fā)酵延遲計(jì)算，總酯生成速率正常延遲時(shí)間是20 h，施以背壓后，延遲作用大大加強(qiáng)。背壓越大，延遲越明顯，0.05 MPa延遲增加20 h，0.15 MPa延遲增加40 h。而且經(jīng)過(guò)延遲后，總酯生成速率峰值被削減。同高級(jí)醇一樣，麥汁濃度與酯類生成量和生成速率正相關(guān)，高濃麥汁在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)高濃度酯類的現(xiàn)象[27]，這種現(xiàn)象可能通過(guò)背壓調(diào)節(jié)進(jìn)行調(diào)控。施以背壓后，總酯生成速率峰值明顯下降（圖8），意味著生成趨勢(shì)變緩，最終使由于麥汁濃度引起的總酯含量差異變小。

圖8 總酯生成速率變化圖

2.3 CO2背壓對(duì)啤酒主發(fā)酵醇酯比的影響

表1表明，采用0.15 MPa的CO2背壓都降低了總的高級(jí)醇和總酯，而減少幅度取決于背壓大小和麥汁濃度。在12°P麥汁中，高級(jí)醇降幅為37%，而8°P麥汁中，高級(jí)醇降幅為42%。在12°P麥汁中總酯的降幅為49%，8°P麥汁中的總酯的降幅為47%（圖3、圖 4）。在0.15 MPa的 CO2背壓下，在12°P麥汁中醇酯比提高了26%，8°P麥汁中只有10%。8°P麥汁所有發(fā)酵樣品醇酯比與12°P麥汁的相比均具有顯著差異；8°P麥汁無(wú)背壓與加背壓發(fā)酵樣品的醇酯比無(wú)顯著差異；12°P麥汁無(wú)背壓與0.05 MPa背壓發(fā)酵樣品的醇酯比無(wú)顯著差異而與0.15 MPa背壓發(fā)酵樣品的醇酯比有顯著差異（P＜0.05）（表1）。即CO2背壓可以平衡風(fēng)味，尤其是高濃度麥汁啤酒。然而，低濃度麥汁啤酒受到輕微影響。

在啤酒中酯類的產(chǎn)生完全是酵母生成。由脂肪酸生成?；o酶A，再以底物的形式與醇反應(yīng)生成酯類，因此，發(fā)酵過(guò)程的各種因素對(duì)酯類的形成將產(chǎn)生綜合影響，如發(fā)酵罐內(nèi)的溫度、壓力、發(fā)酵罐之間的溫度均勻率等等[19]。高級(jí)醇也受多因素影響，CO2背壓是影響因素之一，也是一種有效的調(diào)控方式。

3 結(jié)論

3.1 CO2背壓促進(jìn)CO2的溶解，與麥汁濃度無(wú)關(guān)，抑制和延遲酵母生長(zhǎng)代謝，背壓越高，對(duì)酵母生長(zhǎng)速率峰值的削減越明顯。

表1 CO2背壓對(duì)啤酒主發(fā)酵第10天醇酯比的影響

3.2 CO2背壓顯著延遲高級(jí)醇和酯類的生成，控制總高級(jí)醇和總酯最終生成量，使總高級(jí)醇和總酯生成速率峰值明顯下降，同時(shí)削弱了由麥汁濃度控制高級(jí)醇和酯類生成量的累加效應(yīng)。

3.3 CO2背壓可以提高醇酯比，減輕高濃麥汁啤酒發(fā)酵酯味突出的問(wèn)題，平衡高濃度麥汁啤酒風(fēng)味，對(duì)低濃度麥汁啤酒影響較小。